响应面法优化米曲霉制曲工艺参数研究

引用格式

胡艺嘉,张慧中,汤华成,等.响应面法优化米曲霉制曲工艺参数研究[J].农产品加工,2025,(24):45-50.

基金项目

黑龙江省级大学生创新创业项目（S202310223102X）；黑龙江粮计农业科技有限公司技术委托项目（2023-56）。

摘   要

为探明大豆与面粉质量比为9∶1时的米曲霉对制曲品质的影响，以蛋白酶活力和感官品质为指标，采用单因素试验和Box-behnken响应面法优化了米曲霉制曲工艺参数。结果表明，影响成曲蛋白酶活力的单因素顺序为制曲时 间>米曲霉接种量>制曲温度。当制曲时间48 h，米曲霉接种量0.3%和制曲温度30 ℃时，成曲表面白色菌丝生长厚实，曲味浓郁，菌丝分布均匀且呈新鲜黄绿色；响应面优化后的最优工艺为制曲时间46.143 h，米曲霉接种量0.447%，制曲温度31.222 ℃，成曲的蛋白酶活力达到1 635.78 U/g，为后续豆酱和酱油发酵工艺提供了优质成曲和参数支持。

关 键 词

赤砂糖；发酵；糖组分；理化性质

正   文

酱油和豆酱是我国传统发酵调味品，以大豆和面粉等为主要原料，经制曲和发酵酿造而成，富含类黑精素和黄酮等多种活性物质，具有促消化、抗氧化和降血压等多种保健功能^[1-2]。米曲霉（Asperg-illus oryzae）是一种丝状真菌，生命力强、生长迅速，是目前制曲工艺的主要发酵剂^[3]，广泛用于传统调味品的制曲工艺中^[4]。制曲是酱油和豆酱发酵前的重要生产环节，主要利用人工接种米曲霉在大豆等原料中生长和代谢，分泌产生各种酶，包括蛋白酶、糖化酶和纤维素酶等，在发酵工艺中分解原料并为发酵微生物提供小分子营养物质，为酱油和豆酱的物质转化与合成提供了酶学保障^[5]。制曲过程产生的高蛋白酶活力有利于原料中蛋白质的利用效率^[6]，以及其他原料中营养物质的水解，对酱油和豆酱的营养成分、食用口感和风味形成具有关键作用^[7]。因此，探究米曲霉的最适制曲工艺条件，为提升后续发酵效果及提升酿造食品品质具有重要意义。

不同的大豆和面粉配比是制曲过程中米曲霉生长和产酶的营养基础，大豆与面粉的比例高低，影响制曲体系的透气性、米曲霉的生长和蛋白酶活力^[8]。以大豆与面粉质量比为9∶1的制曲体系，以蛋白酶活力和感官品质为指标，优化米曲霉接种量、制曲温度和制曲时间等单因素制曲条件，进一步利用Box- behnken响应面优化得到最优制曲参数，为酱油和豆酱发酵工艺提供了成曲保障。

1   材料及方法

1.1   材料及仪器

1.1.1   材料与试剂

龙垦306大豆、面粉，市售；酱油曲精（沪酿3.042米曲霉），久微食品科技（上海）有限公司提供；干酪素、福林酚和酪氨酸，北京索莱宝科技有限公司提供；磷酸二氢钠、乳酸和乳酸钠等，均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司提供。

1.1.2   仪器

ZXMP-R1230型恒温恒湿培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；ZYQ-BP20型酱油蒸煮一体锅，泉州中翔机电设备有限公司产品；SHJ-4D型数显恒温磁力搅拌水浴锅，常州金坛良友仪有限公司产品；UV-1500型紫外可见光分光光度计器，上海美析仪器有限公司产品。

1.2   试验方法

1.2.1   原料预处理与单因素制曲工艺

1）原料预处理。以1.5 kg大豆为基础，清洗、浸泡3 h后，在高压锅中蒸煮（温度100 ℃，时间90 min），降温至32 ℃时备用。将0.17 kg未蒸煮的面粉（大豆与面粉质量比为9∶1）与一定量的米曲霉进行充分混合，再与降温大豆进行拌曲操作^[9]。在制曲培养过程中控制曲料湿度为85%，每隔12~14 h翻曲1次，评价成曲的蛋白酶活力和感官品质。

2）单因素制曲工艺。①米曲霉接种量的影响：调整制曲温度30 ℃和制曲时间30 h，米曲霉接种量分别为0，0.1%，0.3%，0.5%，测定成曲的蛋白酶活力并评价成曲的感官品质。②制曲温度的影响：在米曲霉接种量0.3%，制曲时间30 h的条件下，分别调整制曲温度为室温（20 ℃），25，30，35 ℃，测定成曲的蛋白酶活力并评价成曲的感官品质。③制曲时间的影响：当米曲霉接种量0.3%，制曲温度30 ℃时，调整制曲时间分别为12，24，36，48 h，测定成曲的蛋白酶活力并评价成曲的感官品质。

1.2.2   响应面法优化制曲工艺参数

在单因素试验基础上，选择米曲霉接种量、制曲温度和制曲时间为试验因素，每个因素取3个水平，以蛋白酶活力为指标，利用Box-behnken进行米曲霉制曲工艺响应面试验设计。

响应面试验因素与水平见表1。

1.3   指标检测

1.3.1   蛋白酶活力测定

按照张艳芳^[10]的研究方法测定蛋白酶活力。以酪氨酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到酪氨酸标准曲线。蛋白酶活力定义：在温度40 ℃和pH值7.0条件下，每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位（U/g）。酪氨酸标准曲线方程为Y=4.114 4X+0.284 6，R2= 0.997 4，在酪氨酸质量浓度为0~6 μg/mL内线性关系良好。

1.3.2   成曲的感官评价

按照王雪波^[11]酱油成曲感官评价标准，稍作改动。邀请10位具有感官评分经验的人员对成曲进行评分，从成曲的气味和米曲霉生长状态2个方面进行评价。

成曲感官评价标准见表2。

1.4   数据统计

每个样本进行3次平行试验，利用SPSS 27和Excel 2019对试验数据进行统计处理，Design Expert 10.0.7数据分析软件对试验数据进行多元回归拟合，选用Origin 2024作图。

2   结果与分析

2.1   单因素试验优化米曲霉制曲工艺参数

2.1.1   米曲霉接种量对成曲蛋白酶活力和感官品质的影响结果

米曲霉接种量对成曲蛋白酶活力和感官品质的影响见图1。

由图1（a）可知，随着米曲霉接种量的增加，成曲的蛋白酶活力逐渐增加。当米曲霉接种量为0.5%时，蛋白酶活力达到最大值为1 490.95 U/g，与0.3%米曲霉接种量时的蛋白酶活力差异不显著（p> 0.05）。由图1（b）可知，当米曲霉接种量为0.3%时，成曲表面白色菌丝生长均匀，部分有黄绿色孢子，正常曲香。由试验结果可知，当米曲霉接种量较低时，成曲的蛋白酶活力也较低，说明过低的米曲霉接种量在曲中的生长数量受到影响，成曲的蛋白酶活力低；当米曲霉接种量过高时，米曲霉迅速生长繁殖，导致培养表面生物竞争加剧，营养物质匮乏，限制休眠孢子形成数量，也会导致蛋白酶活力下降^[12]。但惠靖茹等人^[13]研究发现，当米曲霉接种量为0.3%时，测得的蛋白酶活力为5 118.16 U/g，与该研究大豆与面粉质量比9∶1不同，主要是由于其选择黄豆粉与糯米粉的配比为1∶2。因此，过高的氮源与碳源比例，易使成曲蛋白酶活力降低，但过高的面粉碳源影响曲料的透气性，进而影响米曲霉的通风效果和氧气供应。综合以上因素，选取米曲霉接种量为0.3%作为进一步响应面设计的中心值。

2.1.2   制曲温度对成曲蛋白酶活力和感官品质的影响结果

制曲温度对成曲蛋白酶活力和感官品质的影响见图2。

由图2（a）可知，制曲温度对蛋白酶活力影响呈现先增加后降低的趋势，当制曲温度为30 ℃时，成曲的蛋白酶活力达到最大值1 242.11 U/g，与其他组差异显著（p<0.05）。由图2（b）可知，成曲呈现白色菌丝厚实，黄绿色孢子明显，曲香味较浓。说明制曲温度升高有利于米曲霉繁殖生长，但随着制曲温度继续升高至35 ℃，蛋白酶活力下降至594.14 U/g。由于制曲温度过高导致曲料水分蒸发，原料硬化，不适合米曲霉生长，抑制米曲霉菌分泌蛋白酶^[14]。大豆中的蛋白质提供米曲霉生长所需的氮源营养，随着制曲温度升高和水分散失，可能影响了氮源的利用率，导致米曲霉生长减缓，蛋白酶活力也随之降低。张婷等人^[15]研究也表明，当制曲温度为30 ℃时，成曲的蛋白酶活力达到最高值。综合以上因素，选取制曲温度为30 ℃作为响应面设计的中心值。

2.1.3   制曲时间对成曲蛋白酶活力和感官品质的影响结果

制曲时间对成曲蛋白酶活力和感官品质的影响见图3。

由图3（a）可知，成曲的蛋白酶活力随制曲时间的延长而增加，在48 h时达到最大值1 520.6 U/g（p< 0.05）。表明米曲霉处于旺盛的生长期，米曲霉菌丝体迅速增加，蛋白酶分泌旺盛^[16]。制曲时间过短时，米曲霉代谢合成蛋白酶较少，蛋白酶活力低^[17]；制曲时间过长时，曲料表面水分散失，供米曲霉利用的氮源和氧分等营养物质缺乏，米曲霉产生的孢子及曲酸等代谢产物大量积累，致使蛋白酶活力下降^[18]。以大豆和麸皮（9∶1）为原料接种米曲霉制曲48 h时，成曲的中性蛋白酶活力最大为82.38 U/g，但曲料易受环境微生物的污染^[19-20]。但当制曲时间为48 h时，成曲菌丝虽厚实，但出现酸味等不良风味情况 [（图3（b）]，48 h制曲时的蛋白酶活力虽然高于36 h，但异味感官易给发酵工艺和产品带来品质影响。因此，选取制曲时间36 h作为响应面设计的中心值。

2.2   响应面优化米曲霉制曲工艺

2.2.1   响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，以成曲的蛋白酶活力（Y）为响应值，利用Box-behnken进行中心组合设计，选择米曲霉接种量（A）、制曲温度（B）和制曲时间（C）为制曲试验因素，优化米曲霉制曲最优工艺参数。

制曲工艺优化响应面试验设计及结果见表3。

以蛋白酶活力为响应值（Y），运用Design Expert 10.0.7数据分析软件对试验数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程如下：

Y=1436.92A+45.04B+344.34C+70.26AB-60.96AC-25.97BC-65.45A2-152.31B2-173.33C2.

回归模型方差分析见表4，试验的模型相关性分析结果见表5。

由表4和表5可知，F值为83.41，模型p<0.000 1，说明模型极显著。失拟项不显著（p=0.329 6>0.05），说明模型可靠。决定系数R2=0.990 8，调整决定系数R2adj=0.978 9，表明97.89%的数据可用该模型解释。变异系数（CV）为3.45%，信噪比为28.616，说明方程可靠性较高，可行性强，数据与该模型拟合程度较好，可用此模型分析预测米曲霉接种量、制曲温度和制曲时间。

根据p值可知，一次项A和C，二次项C2对结果影响极显著（p<0.000 1），二次项交互作用AB和AC对结果影响显著（p<0.05），BC对蛋白酶活力影响不显著（p>0.05）。通过比较F值大小可知，各因素对蛋白酶活力影响大小依次排列为C>A>B，即制曲时间>米曲霉接种量>制曲温度。

2.2.2   响应面分析

响应面图可以比较直观地反映2个变量对蛋白酶活力的影响关系，其中响应面曲面坡度越陡峭，越接近椭圆形，则表明2个变量之间的交互作用越显著^[20]。

各因素交互作用对蛋白酶活力影响的响应曲面图和等高线图见图4。

固定其中一个影响因素，考查另外2个因素对蛋白酶活力的影响。由图4（a）可知，蛋白酶活力的变化坡度随制曲温度和米曲霉接种量的增加呈现先增加后降低的趋势。仅考虑米曲霉接种量和制曲温度交互作用的条件下，当米曲霉接种量为0.4%~ 0.5%，制曲温度为27~33 ℃，蛋白酶活力达到最大值，且蛋白酶活力随米曲霉接种量的变化坡度大于制曲温度，说明米曲霉接种量对蛋白酶活力的影响大于制曲温度。由图4（b）可知，蛋白酶活力的变化坡度随制曲时间和米曲霉接种量的增加呈现逐渐增加后趋于平缓的趋势，仅考虑米曲霉接种量和制曲时间二者交互作用的条件下，当米曲霉接种量为0.4%~0.5%、制曲时间为42~48 h时，蛋白酶活力达到最大值，且蛋白酶活力随制曲时间的变化坡度大于米曲霉接种量，说明制曲时间对蛋白酶活力的影响高于米曲霉接种量。由图4（c）可知，蛋白酶活力的变化坡度随制曲时间和制曲温度的升高呈现先增加后降低的趋势，仅考虑制曲时间和制曲温度交互作用的条件下，在制曲温度为27~33 ℃，制曲时间为42~48 h时，蛋白酶活力达到最大值，且蛋白酶活力随制曲时间的变化坡度大于制曲温度，说明制曲时间对蛋白酶活力的影响大于制曲温度。由图4可知，米曲霉接种量和制曲温度对蛋白酶活力影响有较强的交互作用，对应3D图中两侧坡度较为陡峭，等高线偏椭圆形，其次是制曲时间和制曲温度的交互作用对蛋白酶活力的影响，最后米曲霉接种量和制曲时间交互作用对蛋白酶活力的影响最弱，对应等高线相对平滑，偏圆形。说明米曲霉接种量与制曲温度、米曲霉接种量与制曲时间交互作用均显著（p<0.05），制曲温度与制曲时间有一定的交互作用但不显著（p>0.05），响应面结果与方差分析结果一致。

2.2.3   验证试验结果

根据单因素试验结果，将最优制曲条件修正为制曲时间48 h，米曲霉接种量0.3%，制曲温度30 ℃，在此最优条件下经3次平行试验，蛋白酶活力为1 630.54 U/g。根据响应面法回归方程模型，以蛋白酶活力最大值为评价指标，得到大豆为主要原料的米曲霉制曲工艺优化条件为制曲时间46.143 h，米曲霉接种量0.447%，制曲温度31.222 ℃，在此条件下蛋白酶活力为1 635.78 U/g，与预测值总蛋白酶活力相差小于5%，预测值和试验值之间具有良好相关性，模型优化制曲说明工艺准确可行。

3   结论

在大豆和面粉为原料接种米曲霉制曲的单因素试验基础上，结合响应面试验设计对制曲工艺条件进行优化，评价成曲的感官品质。结果表明，各因素影响大小依次为制曲时间>米曲霉接种量>制曲温度。响应面优化后，蛋白酶活力最大为1 630.54 U/g，成曲感官品质最佳，表面与切面均长满黄绿色孢子，具有成曲浓郁特殊香气。研究确定了大豆与面粉质量比为9∶1时的米曲霉对制曲品质的影响，为酱油和豆酱加工过程中制曲工艺参数提供了参考。在实践中应用，试验将为开发高品质调味品提供前期成曲保障，未来可更深入地研究多种原料预处理方式和菌的种类等，以提高成曲蛋白酶活力和感官品质，为酱油和豆酱的生产提供更多数据支撑。

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