五味子（Schisandra chinensis）是五味子科（Sc- hisandraceae）五味子属（Schisandra）的落叶木质藤本，是我国重要的药食两用植物[1-2]。五味子的药用价值较高，其中木脂素类的含量是其药用效果的主要测定指标[3]。目前，五味子的利用主要集中在果实和根茎之中，对叶片的研究和利用较少。因此，为实现五味子资源的整合开发，缓解五味子果实、根茎的利用压力，寻找替代品和优化提取工艺具有重要意义。

五味子叶片的开发利用，能够实现中药材废弃部位有效应用，对充分利用药用资源具有重要的经济和社会效益。其次，五味子叶片能否成为果实和根茎的替代品，补充市场需求，对五味子的可持续发展及科学应用具有生态意义[4-5]。因此，以五味子叶片的最佳提取工艺为切入点，在3个单因素试验设计基础之上，利用响应面Box-behnken的试验设计方法，将乙醇体积分数、提取温度、提取时间作为考查因素，探究其对五味子叶片中木脂素提取率的最佳工艺，为五味子的叶片利用及工业化木脂素的高效提取提供理论依据。

（一）材料与试剂

五味子叶片，湖南省怀化市通道县黑老虎专业合作社提供；五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子酯甲（批号分别为110857、112108、110764、11529，纯度均为HPLC≥98%），北京索莱宝科技有限公司提供；纯水、95%乙醇（分析纯）。

（二）仪器与设备

FW135型中草药粉碎机，上海楚柏实验室设备有限公司产品；LC-5520型高效液相色谱仪，北京东西分析仪器有限公司产品；AE2204型电子天平，青岛聚创华业分析仪器有限公司产品；Molbiochem型超纯水制水机，骇思仪器科技有限公司产品；CR- 100S型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司产品。

（三）试验方法

1. 木脂素含量测定分析方法的建立

1）溶液配制。①标准品溶液配制：称取4种木脂素对照品适量，以色谱甲醇定容于5 mL容量瓶中，配制质量浓度5 mg/mL的对照品储备液，溶解、摇匀。②供试品溶液配制：精确称取0.1 g的叶片，加入1 mL（75%甲醇）低温匀浆，经超声提取60 min，离心10 min后取上清液，经0.45 μm针式过滤器过滤，滤液即为各样品溶液。

2）色谱条件。Sepax C18型反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：A乙腈，B 0.1%磷酸水，A∶B = 60∶40；流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长220 nm。

3）线性关系考查。精密吸取标准品溶液和样品溶液，分别进样2，4，6，8，10 μL。按照色谱条件测定色谱峰面积，绘制标准曲线，经线性回归计算回归方程、线性相关系数与线性范围，样品溶液与对照品溶液的色谱图。

回归方程与线性范围见表1，对照品和供试品溶液的HPLC图谱见图1。

4）精密度试验。取标准品溶液每次进样10 μL，重复测定5次，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酚、五味子酯甲和五味子甲素峰面积的RSD值分别为2.21%，2.15%，2.10%，1.93%，2.23%，表明仪器精密度良好。

5）稳定性试验。取同一五味子叶片供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，6，8，10 h按照1.3.1中2）色谱条件进行测定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的峰面积RSD值分别为2.42%，2.11%，1.85%，2.11%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

6）重复性试验。分别精密称取同一五味子叶片样品6份，按照1.3.1中1）方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的峰面积RSD值分别为1.34%，1.87%，1.92%，2.08%，表明该方法重复性良好。

7）加样回收率试验。精密称取已知含量的五味子叶片样品6份，加入混合对照品适量，按照1.3.1中1）方法制备加样供试样品溶液。测得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酚、五味子酯甲和五味子甲素的加样回收率分别为95.8%，97.2%，98.9%，99.1%，95.6%；RSD值分别为1.97%，2.13%，2.76%，1.87%，1.65%。

2. 单因素试验

1）乙醇体积分数。准确称取粉碎后的五味子叶片粉末5 g，按照料液比1∶10（g∶mL）加入不同体积分数的乙醇溶液，设置提取温度90 ℃，提取时间120 min，提取次数3次。考查乙醇体积分数分别为55%，65%，75%，85%，95%时对五味子木脂素提取率的影响。

2）提取温度。准确称取粉碎后的五味子叶片粉末5 g，按照料液比1∶10加入体积分数90%的乙醇溶液，设置提取时间120 min，提取次数3次。考查提取温度分别为50，60，70，80，90 ℃时对五味子木脂素提取率的影响。

3）提取时间。准确称取粉碎后的五味子叶片粉末5 g，按照料液比1∶10加入体积分数90%的乙醇溶液，设置提取温度90 ℃，提取次数3次，考查提取时间分别为90，120，150，180，210 min时对五味子木脂素提取率的影响。

3. Box-behnken试验设计

在单因素试验设计的基础之上，准确称取粉碎后的五味子叶片粉末5 g，以乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C）3个因素为自变量，以五味子木脂素提取率为评价指标，考查各因素对提取工艺的影响，每个因素选取3个水平。

Box-behnken响应面法试验因素与水平见表2。

4. 最优工艺验证

根据Design Expert 13软件所得最优提取工艺，对预测值进行对比测验，验证结果的准确性。

（一）单因素试验结果分析

乙醇体积分数、提取温度和提取时间对木脂素提取率的影响见图2。

1）乙醇体积分数对木脂素提取率的影响。由图2（a）可知，随着乙醇体积分数的增加，五味子木脂素提取率随之增加；当乙醇体积分数达到85%时，木脂素提取率达到最高；但乙醇体积分数超过85%后，木脂素的含量增加并不明显，故将体积分数85%的乙醇作为响应面的中心点。

2）提取温度对木脂素提取率的影响。由图2（b）可知，随着提取温度的升高，五味子木脂素提取率随之增加；当提取温度为80 ℃时，木脂素提取率达到最高；当提取温度超过80 ℃后，木脂素提取率出现显著下降的趋势，故将提取温度80 ℃作为响应面的中心点。

3）提取时间对木脂素提取率的影响。由图2（c）可知，随着提取时间的延长，五味子木脂素提取率随之增加；当提取时间达到180 min时，木脂素提取率达到最高；当提取时间超过180 min后，木脂素提取率呈现显著下降的趋势，故选择提取时间180 min作为响应面的中心点。

（二）Box-behnken试验结果分析

1. 响应面优化试验设计结果与方差分析

木脂素提取试验Box-behnken设计及结果见表3。

通过Design Expert13软件对表3的试验结果进行多元线性回归及二项式拟合，得到木脂素提取率（Y）对乙醇体积分数（A）、提取温度（B）和提取时间（C）的二元多项模型方程：

Y=0.429 6+0.758 0A+0.022 6B+0.095 4C-

0.074 1AB-0.045 6AC-0.008 1BC-

0.059 2A2-0.074 5B2-0.070 9C2.

Box-behnken试验回归模型的方差分析见表4。

由表4可知，该回归模型的F=19.97，p<0.000 1，表明该模型极显著，只有0.01%的几率可能会由于噪声而产生如此大的F值。失拟项F=6.32，p=0.053 4，失拟项不显著，表明试验数据很好地适应了模型，试验设计可靠，适合二次回归方程。另外，该模型的相关系数R2=0.974 7，说明97.47%响应面值的变化来自所选的变量，表明方程的拟合度较高，该模型完全可反映五味子木脂素提取率与乙醇体积分数、提取温度和提取时间的关系。该回归模型中，C项对木脂素提取率的影响达到了极显著效应（p<0.000 1）；A、AB、AC、A2、B2、C2项对木脂素提取率有显著影响（p<0.05），其他几项对木脂素提取率的影响不显著（p>0.05）。从p值及F值可看出，3个因素对木脂素提取率的影响显著性大小依次为提取时间>乙醇体积分数> 提取温度。

2. 响应面优化结果

根据拟合结果，利用Design Expert13软件绘制响应面图和等高线图结合响应面模型分析，确定最优提取工艺为乙醇体积分数88.522 0%，提取温度77.188 6 ℃，提取时间168.561 0 min。在此条件下，五味子中木脂素对应预测提取率为0.430 52%。

各因素交互作用对木脂素提取率影响的响应面图及等高线图见图3。

3. 验证试验

为进一步验证模型的合理性，对预测值进行测验。根据生产实际，将各因素的取值进行调整，即乙醇体积分数90%，提取温度80 ℃，提取时间170  min。对得出的最佳提取条件进行验证，在乙醇体积分数、提取温度和提取时间的三者条件下，测出木脂素提取率为（0.45±0.21）%，与预测值的相对误差为1.92%。二者拟合度良好，表明优化结果合理可靠。因此，该模型可用于五味子中木脂素的提取。

五味子中五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲等木脂素类成分具有保肝、镇静、助眠、抗氧化、改善记忆等功效。乔巍和谭玉珊的研究也表明，五味子在不同发育阶段，不同部位均有木脂素的累积。采用无毒无害且价格低廉的乙醇作为提取溶剂，以木脂素提取率为检测指标，通过单因素试验确定乙醇体积分数、提取温度和提取时间的最佳因素水平范围，通过Box-behnken设计试验方案，综合考查三因素的交互作用，最终确定五味子叶片中木脂素的最佳工艺为乙醇体积分数90%，提取温度80 ℃，提取时间170 min。在此条件下，木脂素提取率为0.430 52%；进行验证试验，证明了预测模型的可靠性。研究表明，五味子叶片作为五味子废弃部位具有一定的开发利用价值和研究意义。