东革阿里（Eurycoma longifolia Jack）被称为“马来人参”，是苦木科东革阿里属的多年生药用植物，其主要分布于马来西亚、印度尼西亚及中南半岛各国。在当地常以根茎部位制成茶饮、咖啡或膳食补充剂等形式应用于保健食品中，在保健食品市场上有200多种产品。文献报道其具有增强生殖功能、抗寄生虫及抗肿瘤活性等药理作用。东革阿里富含特征性的苦木素类二萜化合物和生物碱类成分，同时还含有香豆素衍生物、植物蛋白及木脂素等多种活性物质。现代药理学研究证实，该药用植物作为功能性食品添加剂在男性健康领域具有重要应用价值，近年来受到国际药学界的广泛关注。然而，随着其应用范围的扩大，其食用安全性和潜在毒性问题日益受到重视。毒理学研究发现，经有机溶剂分级萃取后，东革阿里正丁醇萃取部位表现出最强的毒性效应，其中宽缨酮被鉴定为关键毒性成分。长期服用含东革阿里成分的制剂可能导致血小板减少及肝肾功能指标异常等不良反应。

采用冷凝回流热水浸提得到东革阿里水提液，其工艺原理与传统水提取工艺（如热水浸提或煎煮等）相通，能有效溶出植物活性成分。改良寇氏法系统评价东革阿里水提取物的急性毒性特征，并测定其对试验小鼠的半数致死量（LD50）。进一步结合网络药理学方法，分析其潜在的肝毒性成分群、分子作用靶点及相关信号通路网络，以期为该药材在功能性食品加工中的合理应用与安全性评价提供科学依据。

（一）材料和试剂

动物：昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，18~22 g，6周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号 SCXK（湘）2019-0004。

东革阿里，购自马来西亚药材市场，由湘南学院刘鹏老师鉴定为苦木科东革阿里属东革阿里，标本保存于湘南学院的湖南省教育厅医药微生物组学重点实验室（标本编号：20130916DGAL）；多聚甲醛，武汉赛维尔生物科技有限公司提供；生理盐水，湖南省金健药业有限责任公司提供；乙醇为分析纯；水为超纯水。

（二）仪器与设备

YB-2000A型高速多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司产品；R-1001VN型旋转蒸发器、SHB-IIIS型台式循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸公司产品；FA1604型电子天平，上海精科天平仪器厂产品；HH-2型数显恒温水浴锅，江苏科析仪器有限公司产品；AG 22331型Hamburg离心机，Eppendorf公司产品。

（一）东革阿里水提取物的制备

取药材饮片500 g，纯水加热回流提取1.5 h，料液比1∶15（V∶V），重复提取1次，合并2次提取滤液，减压浓缩，得东革阿里水提取物，置于4 ℃冰箱中保存备用。

（二）东革阿里灌胃给药急性毒性试验

1. 预试验

选取昆明种小鼠36只，随机分为6组，每组6只，雌雄各半，按照小鼠0.3 mL/10 g灌胃给药，记录小鼠的死亡情况，以获得小鼠全死亡剂量（LD₁₀₀）和全不死亡剂量（LD₀）。测得东革阿里水提取物LD₁₀₀=8 040 mg/kg，LD₀=502.5 mg/kg；在此范围按等比级数分为5组，求得相邻组间剂量公比为0.5，提取物质量分数分别为A组（8 040 mg/kg）、B组（4 020 mg/kg）、C组（2 010 mg/kg）、D组（1 005 mg/kg）、E组（502.5 mg/kg）。

2. 东革阿里水提取物半数致死量LD₅₀的测定

参考文献，分别取60只小鼠，随机分为6组，分别是空白组、不同剂量给药组（8 040，4 020， 2 010，1 005，502.5 mg/kg)，每组10只，雌雄各半。给药前12 h禁食不禁水，12 h后以单次小鼠灌胃最大体积（0.3 mL/10 g）给药，间隔6 h后，按同法操作再给药1次，共2次，给药后持续观察14 d。

3. 观察指标

给药后观察小鼠的行为活动、惊厥、摔倒、竖尾、毛发光泽度、精神状态、体重等。按照孙氏改良寇氏法计算LD₅₀，对死亡小鼠应立即解剖取出组织，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠的病变情况，通过HE染色进行肝、肾病理学观察。

4. 统计学分析

用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据处理。数据以平均值±标准差（X±S）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以p<0.05代表差异有统计学意义。

（三）网络药理学方法

1. 东革阿里及肝毒性作用靶点预测

通过知网、PubMed数据库搜索获得东革阿里的化学成分，在Swiss ADME数据库分析预测东革阿里活性成分的生物利用度，根据胃肠吸收情况（GI）和药物相似性分析（DL）进行分析，在DL分析中具有3个以上“Yes”，同时具有GI是“High”的化合物作为东革阿里的活性成分，导入Swiss Target Prediction平台上，获取成分基因靶点。在Gene Cards疾病数据库以“Liver toxicity”为关键词搜索基因靶点，筛选出肝毒性靶点信息作为疾病靶点，使用Venny 2.1.0平台，导入东革阿里靶点和疾病靶点，获取两者的交集，构建韦恩图。

2. 蛋白质互作网络（PPI）的构建

交集靶点导入String构建PPI网络，并使用Cytoscape 3.9.1 中Network Analysis插件进行拓扑分析，以大于介数中心值（Betweeness）、度（Degree）和紧密中间值（Clossness）的阈值为筛选条件确定得出核心靶点。

3. 靶点蛋白的基因功能和通路分析

在DAVID 2021数据库中进行基因本体GO富集分析和京都基因基因组百科全书KEGG通路富集分析，从GO功能注释中选取BP，CC和MF前10位和KEGG通路富集中的前20位通路，通过微生信进行可视化分析。

（一）东革阿里急毒试验结果

1. 一般症状的观察

空白组14 d内，精神状态良好，无异常表现；不同剂量给药组表现出不同程度的中毒反应。8 040 mg/kg组小鼠呈现出明显中毒现象，如自发活动减少、全身震颤、排便困难及死亡，在给药后第2日全部死亡；其余给药组部分出现活动减少和稀便，未出现痉挛、竖毛、震颤、呼吸抑制等中毒症状。

各组东革阿里水提取物小鼠死亡率的结果见表1。

2. 小鼠体重的影响

不同剂量给药后小鼠体重的变化见图1。

由图1可知，与正常组相比较，不同剂量给药组对体重无显著影响（p>0.05）。

（二）LD₅₀结果

LD50采用改良寇氏法计算，计算公式：LD₅₀=  lg-1［Xm-l（∑P-0.5）］，东革阿里水提取物小鼠急性毒性LD₅₀为2 308.4 mg/kg，95%可信区间为1 494.1~  3 566.7 mg/kg。

（三）病理学观察

解剖死亡小鼠，肉眼观察显示，小鼠心、脾、胃、肺、十二指肠的形状、大小、外观、切片和质地均无明显变化。光学显微镜显示，东革阿里剂量组（1 005 mg/kg）小鼠与空白组相比，肾脏出现肾小球萎缩及肾小管消失；小鼠存在肝细胞脂肪变性，部分小鼠肝脏瘀血。

1 005 mg/kg东革阿里组小鼠肾脏、肝脏的组织病理学观察见图2。

（四）网络药理学结果

1. 东革阿里中活性成分的筛选及作用靶点预测结果

从知网、PubMed、Swiss ADME数据库分析预测东革阿里活性成分有33种，通过Swiss target prediction共得到676个成分基因靶点。

东革阿里活性成分拓扑信息见表2。

2. 东革阿里致肝毒性作用靶点预测

在GeneCards疾病数据库搜索的基因靶点，Relevance score大于中位数筛选出2 501个靶点，使用Venny 2.1.0平台，导入东革阿里活性成分靶点和肝毒性靶点，获取两者的交集靶点328个，构建韦恩图。

东革阿里与肝毒性交集靶点韦恩图见图3。

3. 构建PPI网络确定核心靶点结果

将328个致肝毒性作用的靶点导入String数据库，获得PPI网络。导入Cytoscape 3.9.1 中通过Ne- twork Analysis插件进行拓扑分析，以大于介数中心值、度和紧密中间值的阈值筛选得到51个东革阿里治疗肝毒性核心靶点，节点为基因靶点，节点越大，颜色越深，表示该节点为核心靶点的可能性越大，边数越多表示靶点之间联系越密切。

东革阿里对肝毒性作用核心靶点PPI网络见图4。

由图4可知，排名前10的核心靶点分别是表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、禽肉瘤病毒17的假定转化基因（JUN）、胸腺瘤病毒原癌基因1（AKT1）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、B淋巴细胞瘤- 2（BCL2）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、热休克蛋白90AA1（HSP90AA1）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）。

4. GO与KEGG通路分析

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析见图5。

DAVID数据库进行GO和KEGG分析，其中与生物过程相关的有1 097个条目，主要包括蛋白质磷酸化、蛋白质去磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化等；与细胞组成相关的有130个条目，主要包括细胞质、受体复合体、细胞外外泌体等；与分子功能相关的有248个条目，主要包括蛋白激酶活性、酶结合等，将结果依据Count进行排序，对排序得到的3种条目前10条的进行可视化处理。经KEGG分析，得到了190条相关的信号通道，其中包括癌症、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路等，将前20条进行可视化处理，气泡越大，表示包含的靶点数量越多，颜色越红，表示此通路的富集程度越高。

东革阿里作为一种具有改善男性性功能作用的天然产物，其潜在的经济价值备受关注。然而，其安全性评价尚不充分，限制了进一步的开发与应用。通过急性毒性试验和网络药理学分析，系统评价东革阿里水提取物的毒性效应及其潜在作用机制。

急性毒性试验是药物非临床安全性评价的重要组成部分，可反映单次或短期给药后受试物的毒性特征。经口急性毒性试验结果表明，东革阿里水提取物的LD50为2 308.4 mg/kg，提示其具有一定的毒性风险。值得注意的是，给药8 040~1 005 mg/kg的小鼠在4 h后即出现自发活动减少、全身震颤及间歇性死亡等急性中毒症状，且病理学检查1 005 mg/kg组小鼠显示肝脏和肾脏组织存在明显损伤。尽管小鼠的体重和摄食量未出现显著变化，但高剂量下的毒性反应提示临床应用中需严格把控剂量范围。

为进一步探究东革阿里的毒性机制，采用网络药理学方法筛选出其33种潜在活性成分，其中9-methoxycanthin-6-one，5-hydroxymethyl-9-methox- ycanthin-6-one和Piscidinol A等生物碱类成分度值大，说明该类成分与肝毒性密切相关。通过蛋白互作网络（PPI）和拓扑分析，进一步鉴定出51个核心毒性靶点，包括EGFR，ESR1，JUN，AKT1和GAPDH等。KEGG通路富集分析表明，这些靶点主要富集于癌症、脂质代谢与动脉粥样硬化、PI3K- Akt信号通路等。有研究指出，GAPDH作为糖酵解的关键限速酶，其异常表达可能通过介导细胞内铁沉积而引发细胞毒性；AKT1作为PI3K/Akt信号通路的核心调控因子，在肝细胞凋亡和自噬过程中发挥重要作用，促进肝脏疾病的发生发展，这与试验中观察到的肝组织病理学改变相一致。因此，东革阿里的肝毒性可能与其生物碱成分通过PI3K/ Akt等通路诱导肝细胞凋亡和自噬有关。综上所述，通过试验毒理学和网络药理学相结合的方法，证实东革阿里水提取物在高剂量下具有明显的肝毒性，建议在临床转化时必须严格确立安全剂量范围，后续研究可开展亚急性或亚慢性毒性试验，以确定“未观察到有害作用的剂量水平”。在此基础上，结合种属间剂量换算系数，推导并提出成人每日摄入量的建议上限。网络药理学分析明确指出，9 -甲氧基铁屎米酮等生物碱成分与肝毒性高度相关。因此，优化提取工艺以降低这些成分的富集是关键，可结合膜分离、柱层析等纯化技术，主动分离或去除已识别出的毒性成分，从而获得更安全的提取物。同时建立针对性的产品质量控制体系，将关键毒性生物碱成分（如9-methoxycanthin-6-one等）作为必须检测的安全性指标，并设定严格的含量限度标准，以建立东革阿里更全面的安全性评价体系。