甘蔗糖蜜，是甘蔗制糖工业的副产物，据相关文献报道，其年产量高达290万t左右，成分复杂、流动性差、黏度高，常规方法很难处理。但由于其主要成分是蔗糖和还原糖，且含有无机盐、维生素和氨基酸等营养成分，有利于微生物的生长。因此，将其作为原料发酵生产酒精，既能解决甘蔗糖业对环境的直接污染问题，又能变废为宝，显著提高甘蔗制糖副产物的利用价值，具有重要的产业意义。然而，实现以甘蔗糖蜜为原料生产乙醇的关键在于提高发酵水平。目前，提升乙醇的发酵水平有2个方面，一是要获得优良菌种，二是优化发酵工艺，其中优良菌种是发酵工业的核心，所以选择可忍受不良环境且高产的菌株是提高乙醇发酵水平的基础。

目前，许多研究通过在原亲本酵母菌株的基础上提高其对不良环境的耐受性，从而增强其对环境的适应能力，获得更高的乙醇产量。在以葡萄糖液为发酵基质的条件下，孙言秋等人通过提高酿酒酵母对高温的耐受性，发酵98.36 g/L葡萄糖生产质量浓度为43.68 g/L的乙醇，与原菌株相比，乙醇产量提升了4.77%。谭慧萍等人则提高了酿酒酵母的乙醇耐受性，获得的2株酿酒酵母在发酵300 g/L 的葡萄糖培养基72 h 时，乙醇质量浓度分别为116.2， 119.0 g/L，比不耐高乙醇的原菌株分别提升了19.4%和22.3%。然而，甘蔗糖蜜与葡萄糖液相比，含有许多可抑制酿酒酵母的有害物质，加之发酵过程中出现的高乙醇、高糖、高温、低pH值等高胁迫环境，使得酵母菌株在发酵甘蔗糖蜜产乙醇的效果并不理想。因此，试验以研究团队前期选育获得的耐受高乙醇、高糖、高温、低pH值的酿酒酵母菌株SCT1为研究对象，测定其在以甘蔗糖蜜为培养基下的生长曲线及产乙醇量变化曲线，明确高耐受性酿酒酵母SCT1在甘蔗糖蜜中的生长性能和发酵特性，并与原亲本菌株CICC 33068进行对比，明确酵母SCT1在发酵甘蔗糖蜜产乙醇方面的应用优势。未来，将对酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇过程进行工艺优化，获得其最佳发酵条件，提高乙醇得率，为甘蔗糖蜜的进一步利用奠定科学基础。

（一）材料与试剂

菌株：CICC 33068，高体积分数乙醇胁迫环境逐步驯化实验室保藏；SCT1，由菌株33068辐射诱变联合适应性驯化技术获得。

甘蔗糖蜜；D -无水葡萄糖、七水硫酸镁、蔗糖、脲（尿素）、磷酸二氢钾、硫酸、磷酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

（二）培养基

1）生长培养基（Yeast extract peptone dextrose medium，YPD）。葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取粉10.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，于115 ℃下蒸汽灭菌20 min。固体培养基另外加入20 g/L琼脂。

2）蔗糖培养基。蛋白陈20 g/L，酵母粉10 g/L，蔗糖 400 g/L，自然 pH 值，于115 ℃下灭菌20 min。

3）甘蔗糖蜜发酵培养基。将糖蜜稀释至20°Bx，并添加0.2％的尿素和0.02％的磷酸，用硫酸调pH值至3.8~4.0，于115 ℃下灭菌20 min。

4）55 °Bx甘蔗糖蜜。将甘蔗糖蜜稀释至55°Bx，并添加0.2％的尿素和0.02％的磷酸，用硫酸调pH值至3.8~4.0，于115 ℃下灭菌20 min。

（三）仪器与设备

UltiMate 3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司产品；ReadMax 1200型光吸收全波长酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司产品；LRH- 100-HSE型恒温恒湿培养箱，上海森信实验仪器有限公司产品；HZQ-F100型恒温摇床，常州诺基仪器有限公司产品；Sartarins型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；YSQ-LS-50S11型压力蒸汽灭菌锅，上海中安医疗所产品；SW-CJ-1D型落地式洁净工作台，上海邦西仪器科技有限公司产品；S200K型多参数分析仪，梅特勒-托利多集团公司产品；78Hm-1型恒温磁力搅拌器，江苏金怡仪器科技有限公司产品；YK1207601型光学显微镜，上海佑科仪器仪表有限公司产品。

（四）试验方法

1. 菌株在甘蔗糖蜜中的生长测定

将2株菌株从保种斜面挑取单菌落接种至YPD液体培养基上，在恒温恒湿摇床设置转速180 r/min，温度30 ℃过夜培养活化后，再培养至对数期菌龄，接种至20°Bx甘蔗糖蜜培养基置于温度30 ℃，转速180 r/min下培养，定期取甘蔗糖蜜发酵液样品进行菌数和吸光度测定，获得菌株的生长曲线和菌数与吸光度（OD₆₀₀）的线性关系。

2. 酒精发酵

甘蔗糖蜜酒精发酵按当前甘蔗糖蜜酒精发酵的发酵工艺，将活化后的菌株培养8 h至对数期菌龄，菌落数1×10⁸ CFU/mL，接种至20°Bx甘蔗糖蜜培养基中，接种量5%，培养时间8 h，补料同体积55 °Bx的甘蔗糖蜜培养基，启动酒精发酵；蔗糖酒精发酵按甘蔗糖蜜酒精发酵工艺流程，在活化培养至对数期菌龄后，补料同体积蔗糖液体培养基进行酒精发酵。启动酒精发酵前24 h在温度30 ℃，转速180 r/min恒温恒湿摇床中培养。随后，在30 ℃培养箱中静置发酵，期间均匀取样并稀释10倍后滤去菌株，进行液相分析。

3. 培养基中各组分含量测定

利用HPLC测定葡萄糖、果糖、乙醇的含量，以不同质量浓度的单体葡萄糖、果糖、乙醇混合标准液样品进样绘制标准曲线，计算样品中葡萄糖、果糖、乙醇的含量。

色谱柱：Bio-RAD AminexR HPX-87H Ion Exclusion Column（300 mm×7.8 mm）；流动相0.005 mol/L H₂SO₄溶液，流速0.6 mL/min，柱温55 ℃，柱后冷却温度30 ℃，示差折光检测器（Refractive indexdetector，RID），检测器温度45 ℃，进样体积10 μL。

（五）高耐受性酿酒酵母酒精发酵工艺优化

1. 单因素试验设计

以菌种配比、转速条件、发酵温度为因素，以乙醇含量为单因素试验评价指标进行发酵试验。

2. 正交试验设计

利用SPSS Statistics 21设计关于温度、转速、接种量的三因素三水平正交试验表进行试验操作。

甘蔗糖蜜发酵条件正交试验因素与水平见表1。

（六）数据处理方法

采用Microsoft Excel 2019进行试验数据汇总，SPSS Statistics 21对数据进行正交试验分析，采用Graph Pad. Prism 9.5.0软件作图。

（一）酵母SCT1和菌株33068在甘蔗糖蜜培养基中的生长状况

2株菌株吸光度（OD₆₀₀）与时间的关系见图1，2株菌株菌落数与时间的关系见图2。

由图1可知，在8 h进入对数期后，酵母SCT1的菌落数及生长速率始终高于菌株33068，说明在甘蔗糖蜜中酵母SCT1仍然体现出优良的生长性能，这可能与酵母SCT1的耐高糖性能相关。在20 h菌株生长进入平稳期后，由于培养基中营养消耗产生的有机酸、H₂O₂等毒性产物积累及pH值下降等因素，对菌株的生长繁殖产生不利影响。菌株33068在20~ 40 h中出现了菌落数下降的现象，但酵母SCT1在20 h后吸光度（OD₆₀₀）仍在继续增长，表明酵母SCT1在糖蜜中对生长过程中产生的不利条件耐受性能更强。

由图2可知，酵母SCT1在0~32 h培养过程中出现的菌落数始终多于菌株33068，在对数期时差距明显，且酵母SCT1在0~32 h的最大菌落数为6.15×10⁸ CFU/mL，大于菌株33068的最大菌落数4.05×10⁸ CFU/mL，可直观地说明酵母SCT1对以甘蔗糖蜜为培养基的条件适应更加出色，说明比市面上的同种菌株在甘蔗糖蜜中具有生长优势。

为确定酵母SCT1和菌株33068的菌落数分别与吸光度（OD₆₀₀）关系，以2株菌株的菌落数（CFU/mL）为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标，得到回归方程分别为Y= 7×10⁸X-1×10⁷，R²=0.991 8和Y=6×10⁸X-6×10⁶，R²=0.989 6，便于后续酒精发酵时观察菌落数。

酵母SCT1菌落数与吸光度（OD₆₀₀）的相关曲线见图3，菌株33068菌落数与吸光度（OD₆₀₀）的相关曲线见图4。

（二）酒精发酵情况

不同时段酵母SCT1和菌株33068培养基中不同成分的含量见图5。

由图5（a）可知，酵母SCT1不论是在蔗糖培养基还是在甘蔗糖蜜培养基，在启动发酵72 h的产乙醇量均显著高于（p<0.05）菌株33068，且对比蔗糖培养基，甘蔗糖蜜培养基中有许多胶体、色素、金属离子和灰分等物质，这些非糖杂质占甘蔗糖蜜的较大部分，不仅如此，这些物质还会严重影响酵母细胞，说明提高酵母的耐受性对于提高在甘蔗糖蜜培养基的酒精发酵能力极为重要。酵母SCT1和菌株33068发酵蔗糖72 h后残留葡萄糖和果糖含量相差不明显的情况下（p>0.05），酵母SCT1的产乙醇量明显高于（p<0.05）菌株33068，说明在蔗糖培养基中酒精发酵72 h下酵母SCT1的可发酵性糖利用率大于菌株33068。在甘蔗糖蜜培养基中，酵母SCT1的残留葡萄糖和果糖质量浓度都显著低于（p<0.01）菌株33068，产乙醇量显著高于（p<0.05）菌株33068，说明在甘蔗糖蜜培养基中酒精发酵72 h时酵母SCT1的可发酵性糖利用率大于菌株33068。发酵 72 h时甘蔗糖蜜及蔗糖培养基中乙醇质量浓度分别为85.04，109.46 g/L，较菌株33068分别提高了7.16%和5.90%。且72 h后酵母SCTI的乙醇产量在11%（V/V）左右，高于我国一般的甘蔗糖蜜酒精发酵的醪液乙醇体积分数10%（V/V）左右，证明具有高耐受性的酵母SCT1在发酵甘蔗糖蜜的产乙醇能力较为突出。

由图5（b）可知，酵母SCT1在整个甘蔗糖蜜酒精发酵阶段产乙醇量均多于菌株33068，残还原糖均少于菌株33068，表现出酵母SCT1在甘蔗糖蜜中酒精发酵的稳定性。

由图5（c）和（d）可知，酵母SCT1与菌株33068 2株菌在启动酒精发酵后的24 h中均快速消耗葡萄糖和果糖。在72 h后，葡萄糖和果糖的消耗速度均下降，质量浓度也开始趋向平稳。酵母SCT1的培养基中葡萄糖质量浓度在48 h时开始平稳，而菌株33068则是在72 h。同理，对比培养基中果糖质量浓度，则分别在24 h和48 h趋向平稳。由此可知，在利用果糖、葡萄糖速率方面，酵母SCT1具有优势。在启动酒精发酵后，酵母SCT1培养基中葡萄糖果糖均小于菌株33068，可直观地说明酵母SCT1对可发酵性糖的利用率相较菌株33068来说更高。酵母培养基中果糖质量浓度明显高于葡萄糖质量浓度，出现这个现象的原因是：葡萄糖和果糖通过酵母细胞膜进入酵母细胞及其中的代谢、催化途径基本相同，但由于酵母对二者的亲疏性不同，酵母细胞会首先利用葡萄糖，然后利用果糖，所以培养基中残留葡萄糖的质量浓度显著低于残留果糖的质量浓度。

（三）酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇条件优化

酵母SCT1在不同条件下启动酒精发酵72 h后培养基乙醇质量浓度见图6。

1. 转速对酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇的影响

溶氧水平对于酵母发酵生成乙醇而言有利有弊：一方面，微量的溶氧是酵母保持细胞活性，提高乙醇耐受性必需的；另一方面，又会抑制糖酵解途径，减少乙醇合成前体物质，降低乙醇得率。在装液量条件固定的情况下，由图6（a）可知，在酒精发酵过程中转速90 r/min相较于转速180 r/min产乙醇量更多，说明溶氧量及营养物质的充分混合影响乙醇质量浓度。对比静置情况，转速高、溶氧量大，抑制酒精发酵现象明显，导致静置时的产乙醇量大于上述转动条件。

2. 接种量对酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇的影响

在一定生长环境中菌数影响着微生物的生长繁育，所以酵母菌产乙醇率受到接种量的直接影响。研究表明，接种量过低会导致菌株延滞期延长，从而延长进入酒精发酵的时间，因此相同时间下酵母发酵甘蔗糖蜜产乙醇得率低。但接种量过高，虽可减少杂菌污染并快速进入对数期，但可能会因为同种之间由于菌数过多相互竞争导致营养物质或氧气不足，从而影响酵母的乙醇产量。由图6（b）可知，通过研究接种量对酵母SCT1产乙醇的影响发现，接种量5%的条件相较于其他接种量要好，在这一条件下可快速达到酒精发酵的最佳时间，又可防止杂菌污染，提高发酵甘蔗糖蜜的利用率。接种量1%时，酵母SCT1在酒精发酵72 h可能仍未到其产乙醇量的最大值；接种量10%时，酵母SCT1在酒精发酵前由于菌落数大，相互竞争导致营养物质减少，造成可发酵性糖或细胞活性不足，导致酵母产乙醇量减少。

3. 温度对酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇的影响

温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处于最适生长温度时，有刺激生长和生理活动的作用；不适宜的温度会导致细菌形态和代谢的改变或使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡。温度对微生物的影响具体表现在酶活性、细胞膜的流动性和物质的溶解度方面。温度对酵母酒精发酵的影响，主要影响酵母内参与酒精发酵相关酶的活性来调控其酒精发酵。由图6（c）可知，在30 ℃下进行酒精发酵时，酵母SCT1发酵产乙醇较高。

4. 酒精发酵前处理对酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇的影响

由图6（d）可知，先将酵母SCT1接种至20°Bx甘蔗糖蜜培养8 h后，再补料55 °Bx糖蜜发酵至24 h后启动酒精发酵比直接将其混匀接种培养，在启动酒精发酵72 h后乙醇质量浓度较高，说明接种在20°Bx甘蔗糖蜜培养8 h，提前给予酿酒酵母合适的环境条件下进行生长繁殖，可更好地适应逆境。

5. 酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇的优化正交试验分析

甘蔗糖蜜发酵乙醇优化正交试验结果见表2。

正交试验结果的最优因素组合为A₁B₂C₃ ，主要因素C>B>A，重复进行3次平行验证试验，发酵甘蔗糖蜜乙醇质量浓度的平均值为95.24 g/L，与原试验条件相比，72 h产乙醇量提高了11.99%，因此，酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜最佳的温度为25 ℃，转速为90 r/min，接种量为10%。

以高耐受性酵母SCT1为研究菌株，对比亲本菌株CICC 33068，分别通过探究其在20°Bx甘蔗糖蜜培养基生长情况，在甘蔗糖蜜和蔗糖培养基中酒精发酵各组分含量情况，来评估高耐受性酵母SCT1在甘蔗糖蜜中酒精发酵能力。结果表明，在20°Bx甘蔗糖蜜培养基中的培养，酵母SCT1的最大菌落数为6.15×10⁸ CFU/mL，大于菌株33068的最大菌落数4.05×10⁸ CFU/mL，且进入对数期的时间更短，衰退期的菌数维持量更多。在酒精发酵试验中，酵母SCT1在启动酒精发酵后的72 h，甘蔗糖蜜及蔗糖培养基中乙醇质量浓度分别为85.04，109.46 g/L，较菌株33068分别提高了7.16%和5.90%，而且甘蔗糖蜜培养基中残留的葡萄糖和果糖质量浓度均小于菌株33068，说明酵母SCT1具有比菌株33068更强的酒精发酵能力。此外，通过单因素试验与正交试验，进一步探究酵母SCT1发酵甘蔗糖蜜产乙醇在温度、溶氧量、接种量等因素影响下的最佳条件，推测接种量为影响发酵的主要因素，其次是溶氧量和温度，且酵母SCT1最佳酒精发酵条件为温度25 ℃，转速90 r/min，接种量10%，72 h产乙醇质量浓度为95.24 g/L，相较原条件提高11.99%。阐述了经驯化后的高耐受性酵母SCT1在20°Bx甘蔗糖蜜下的生长情况及其产乙醇能力，初步证明了高耐受性酵母对比亲本菌株在发酵甘蔗糖蜜所具备的优势，获得了提高酵母的耐受性与其产酒精能力，也为探究其最佳酒精发酵条件提供了一定的理论依据。