近年来，我国的玉米产业发展迅速，玉米已成为继水稻后的第二大粮食作物。在玉米加工过程中，玉米皮和玉米芯作为主要副产物，分别占玉米总质量的14%~20%和10%~20%。玉米皮和玉米芯含膳食纤维高达60%~70%，且这些膳食纤维中含有大量低聚木糖。低聚木糖是由2~8个单糖分子通过糖苷键构成的聚合物，可直接被益生菌利用并产生多种有机酸，从而降低肠道pH值、抑制有害菌生长、促进益生菌在肠道内大量增殖，达到保健的效果。

传统低聚木糖的提取方法主要包括物理、化学和酶法3种方法。采用物理法提取的效率相对较低，能耗较高且过程繁琐。在化学法提取过程中存在酸浓度的控制较为困难、仪器容易受到腐蚀、碱环境污染严重等缺点。因此，选用生产工艺耗能少、绿色无污染的酶法。在此基础上，结合超高压方法，可提高低聚木糖的提取率。超高压技术主要是通过施加100~1 000 MPa的超高压力，对细胞结构产生深刻影响，导致其形态发生改变，进而使构成生物大分子立体结构所依赖的氢键、离子键及疏水作用键等非共价键进行调整，以此提升物质的提取效率。超高压辅助酶法是近年来新兴的提取方法，所提取出的活性物质相较于单一提取方法活性较高，且具有操作简便、提取物均匀、不易引起化学反应等优点。

采用超高压辅助酶法提取玉米秸秆中低聚木糖，考查超高压压强、超高压时间、料液比和酶添加量对低聚木糖提取率的影响，并通过响应面分析优化超高压预处理条件。此外，通过测定DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力，探究低聚木糖抗氧化性的强弱。

（一）材料与试剂

玉米秸秆，哈尔滨友博生物科技有限公司提供；木聚糖酶（7 000 U/g），上海润盈生物工程有限公司提供；磷酸氢二钠、柠檬酸、3,5 -二硝基水杨酸，均为国产分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

（二）仪器与设备

高静压处理设备（容积3 L，压力0~300 MPa，波动0~2 MPa），沈阳人和机电设备有限公司产品；WKF-20BZ型高速万能粉碎机，北京格瑞德曼仪器设备有限公司产品；CTK120C型离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；SP-752/752PC型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；HH600-2B型恒温水浴锅，上海启前电子科技有限公司产品；FA- G系列感应窗型分析天平，常州万泰天平仪器有限公司产品。

（三）工艺流程

玉米秸秆→预处理→提取木聚糖→酶解→酸沉→洗脱→低聚木糖。

（四）试验方法

1. 超高压压强对低聚木糖质量浓度的影响

分别设置超高压压强为100，150，200，250，300 MPa，调整超高压时间为3 h，料液比为1∶25（g∶mL），酶添加量为1.5%，考查不同超高压压强对低聚木糖质量浓度的影响。

2. 超高压时间对低聚木糖质量浓度的影响

设置超高压压强为200 MPa，调整超高压时间为1，2，3，4，5 h，料液比为1∶25，酶添加量为1.5%，考查不同超高压时间对低聚木糖质量浓度的影响。

3. 料液比对低聚木糖质量浓度的影响

设置超高压压强为200 MPa，超高压时间为3 h，分别调整料液比为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30， 1∶35，酶添加量为1.5%，考查不同料液比对低聚木糖质量浓度的影响。

4. 酶添加量对低聚木糖质量浓度的影响

设置超高压压强为200 MPa，超高压时间为3 h，料液比为1∶25，分别调整酶添加量为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，考查不同酶添加量对低聚木糖质量浓度的影响。

5. 响应面优化工艺参数

为了确定最优超高压提取低聚木糖工艺条件，以单因素试验为基础，利用响应曲面法进行优化处理，即以超高压压强、超高压时间、料液比及酶添加量为自变量，低聚木糖质量浓度为响应值，设计四因素三水平优化试验。

试验因素与水平见表1。

（五）抗氧化活性研究

1. 还原糖的测定

还原糖测定用3,5 -二硝基水杨酸（DNS）法：在25 mL比色管中取1 mL样品，用去离子水稀释质量浓度为0.5~3.5 g/L，加入1 mL DNS试剂，沸水浴中浸泡5 min，立刻冷却定容至25 mL，于波长550 nm处测定吸光度（A₅₅₀）。通过标准曲线方程得出还原糖含量，以还原糖含量代表酶解后的低聚木糖含量。

2. DPPH自由基清除能力的测定

参照文献方法并做适当修改，采用体外DPPH法测定发酵后清除DPPH自由基的能力。取发酵液0.2 mL，接着将浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液加入其中，并充分摇晃均匀后，静止放置大约30 min，于波长517 mm处测定吸光度。甲醇溶液作为空白，样品加DPPH为样品组A_S，甲醇替代提取液作为控制组A₀。

3. 超氧阴离子自由基清除能力测定

参照文献方法并做适当修改，分别吸取Tris- HCl缓冲液（浓度0.05 mol/L，pH值8.2，先置于25 ℃预热20 min）4.5 mL，样液（空白对照组以生理盐水代替样液）4.4 mL，邻苯三酚溶液（用浓度为10 mmol/L的HCl溶液配制，调零管用浓度为10 mmol/L的HCl溶液代替邻苯三酚的HCl溶液）混合均匀，于25 ℃水浴反应5 min后加入浓度为8 mol/L的HCl溶液终止反应，于波长325 nm处测定吸光度。

式中：A_样品——样液管的吸光度；

A_空白——空白管的吸光度。

4. 羟自由基清除能力测定

参照文献方法并做适当修改，分别吸取Tris- HCl缓冲液（浓度0.05 mol/L，pH值8.2，先置于25 ℃预热20 min）4.5 mL，样液（空白对照以生理盐水代替样液）4.4 mL，邻苯三酚溶液（用浓度为10 mmol/L的HCl溶液配制，调零管用浓度为10 mmol/L的HCl溶液代替邻苯三酚的HCl溶液）混合均匀，于25 ℃水浴反应5 min后加入浓度为8 mol/L的HCl溶液终止反应，于波长325 nm处测定吸光度。

式中：A₀——空白管的吸光度；

A_s——样液作为自由基清除剂加入后的吸光度。

（六）试验数据处理

所有数据通过3次测定后取平均值，用Origin 9.1软件做图，SPSS V 19.0软件分析其显著性，响应面分析采用Box-behnken模型。

（一）单因素试验结果与分析

1. 不同超高压压强对低聚木糖质量浓度的影响

不同超高压压强对低聚木糖质量浓度的影响见图1。

由图1可知，随着超高压压强的增大，低聚木糖质量浓度先增长后下降，当超高压压强为200 MPa时，低聚木糖质量浓度将达到最大值。可能是高压既可影响酶的构象（如催化中心暴露），也可使原料更加疏松，使反应进行彻底、迅速。在超高压压强为200~300 MPa时，低聚木糖质量浓度开始缓慢下降，由于压力能在一定程度上促进反应进行，但压力太大，使酶催化结构变化，其作用失活，从而导致提取率下降，最终导致低聚木糖质量浓度降低。

2. 不同超高压时间对低聚木糖质量浓度的影响

不同超高压时间对低聚木糖质量浓度的影响见图2。

由图2可知，随着超高压时间的不断延长，低聚木糖质量浓度呈先迅速升高后缓慢降低的趋势。当超高压时间为3 h时，低聚木糖质量浓度最高。这可能是因为在一定的时间范围内，时间越长，反应越充分，但超高压时间过长可导致有效成分分解，降低低聚木糖的提取率，同时也会造成能量和资源的浪费。因此，超高压时间选择3 h为最佳。

3. 不同料液比对低聚木糖质量浓度的影响

不同料液比对低聚木糖质量浓度的影响见图3。

由图3可知，随着料液比的增加，低聚木糖质量浓度逐渐增加，当料液比为1∶25时，低聚木糖质量浓度最高；当料液比大于1∶25时，低聚木糖质量浓度增加得较为缓慢。这可能是由于料液比升高，溶液稀释度大、黏度降低，导致低聚木糖析出较少。因此，最优料液比应选择1∶25。

4. 不同酶添加量对低聚木糖质量浓度的影响

不同酶添加量对低聚木糖质量浓度的影响见图4。

由图4可知，随着酶添加量的增加，低聚木糖质量浓度先升高后下降。在酶添加量为1.5%时，低聚木糖质量浓度达到最大；当酶添加量小于1.5%时，低聚木糖质量浓度增长幅度较大；但当酶添加量大于1.5%时，低聚木糖质量浓度发生了缓慢下降趋势。这是因为，虽然酶与底物的结合会随着酶添加量增加而增加，但在反应过程中，底物的有限性会限制其反应，所以在添加一定的酶后，低聚木糖质量浓度便不再随着酶添加量的增加而增加。因此，最佳酶添加量为1.5%。

5. 响应面法优化超声处理工艺

试验方案及结果见表2。

通过统计分析软件Design Expert进行数据分析，得到关于R的方程为：

R=8.10-0.20A+0.18B-0.16D-0.49AB-0.45AC-

0.92AD-0.02BC+0.03BD-0.01CD-1.99A²-

1.22B²-0.68C²-0.46D².

方差分析见表3。

由表3可知，方程表现出显著差异（p<0.000 1），这也表示通过此次研究进行模拟的效果与理论十分接近，均方值R²=93.86%，且失拟项为0.057 1，无显著特征，这也表示通过模型研究可说明93.86%的响应变化，R²_adj为87.73%，说明仅有12.27%的总变异是该模型无法预测的，达到了非常高的拟合程度，通过F值大小能判断出各因素的影响大小，由高至低依次为A>B>D>C，即超高压压强>超高压时间>酶添加量>料液比。

两因素交互作用对低聚木糖质量浓度影响的响应面图见图5。

通过以上模型可知，在超高压压强199.37 MPa，超高压时间3.04 h，料液比1∶25.05及酶添加量1.46%条件下，所得到的低聚木糖质量浓度能达到8.12 g/L。结合实际生产中的工艺水平，调整为超高压压强200 MPa，超高压时间3 h，料液比1∶25，酶添加量1.5%。采用上述的工艺条件实际提取3次进行验证，其结果所得平均值为8.03 g/L，与理论预测值相差1.11%。因此，通过上述方法测定出的工艺条件准确可靠。

（二）玉米秸秆低聚木糖的抗氧化活性

1. DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力见图6。

由图6可知，随着质量浓度的增加，低聚木糖的DPPH自由基清除率保持着几乎相同的速率在稳定增长，DPPH自由基清除率高，说明其抗氧化能力强。当质量浓度为1 000 μg/mL时，低聚木糖的DPPH自由基清除率达到最高，其抗氧化性能力也达到最强。同样对维C进行分析，在质量浓度为500 μg/mL时，维C的DPPH自由基清除率与低聚木糖的变化相同，处于一个稳定增长的状态，而在质量浓度500~750 μg/mL时发生下降，随后在质量浓度1 000 μg/mL时又迅速增长并超过了质量浓度为500 μg/mL时的DPPH自由基清除率。对比低聚木糖与维C可知，同一质量浓度之下，维C的DPPH自由基清除率及抗氧化性都强于低聚木糖。

2. 羟自由基清除能力的测定

羟自由基清除能力见图7。

由图7可知，随着质量浓度的增加，低聚木糖的羟自由基清除率处于稳步增长的状态，羟自由基清除率高，说明其抗氧化能力强。当质量浓度为1 000 μg/mL时，低聚木糖的羟自由基清除率达到最高，其抗氧化性能力也达到最强。据此分析维C的羟自由基清除率，随着质量浓度的增加，维C的羟自由基清除率先增长后下降再增长，最终在质量浓度为1 000 μg/mL时达到最高，与低聚木糖结果一样，在质量浓度为1 000 μg/mL时，维C的羟基自由基清除率达到最高，其抗氧化性能力也达到最强。对比二者，维C的羟自由基清除率及抗氧化性都强于低聚木糖。

3. 超氧阴离子自由基清除能力的测定

超氧阴离子自由基清除能力见图8。

由图8可知，随着质量浓度的增加，低聚木糖的超氧阴离子自由基清除率先增加后降低，超氧阴离子自由基清除率高，说明其抗氧化能力强。当质量浓度为750 μg/mL时，低聚木糖的超氧阴离子自由基清除率达到最高，其抗氧化性能力也达到最强。因此，对于维C来说，随着质量浓度的增加，维C的超氧阴离子自由基清除率先增长后下降再增长，最终在质量浓度为1 000 μg/mL时达到最高，与低聚木糖结果一样，在质量浓度为1 000 μg/mL时，维C的超氧阴离子自由基清除率达到最高，其抗氧化性能力也达到最强。对比二者，维C的超氧阴离子自由基清除率和抗氧化性都强于低聚木糖。