苜蓿（Medicago sativa L.）为多年生豆科苜蓿属草本植物，具有抗寒、抗旱、耐盐碱等特性，被誉为“牧草之王”，富含蛋白质、维生素、矿物质及多种生物活性成分，常被用于利尿、降胆固醇及缓解更年期症状等。现代研究表明，苜蓿中含有黄酮类、多糖、皂苷等功能成分，具有抗氧化、免疫调节、降血糖及抗炎等多种生物活性。其中，苜蓿多糖（Medicago sativa L. polysaccharide，MSP）作为重要活性成分之一，因其显著的免疫增强、抗氧化及抗肿瘤等作用而受到广泛关注，在功能食品和医药领域展现出良好的应用前景。然而，苜蓿多糖的理化特性及生物活性受提取方法影响显著，且构效关系尚不明确，制约了苜蓿多糖的深度开发与应用。梯度醇沉法因其操作简便、条件温和且易于放大生产，已成为多糖分级制备的常用方法。通过调节乙醇体积分数可获得具有不同组成和活性的多糖组分，为解析多糖构效关系提供了有效手段。目前，苜蓿多糖的研究多集中于单一体积分数乙醇沉淀（如体积分数80%），尚未系统开展50%，60%和70%乙醇梯度醇沉的比较研究，也缺乏不同醇沉组分在理化特性与抗氧化活性方面的系统评价。

因此，采用体积分数50%~80%乙醇对苜蓿多糖进行梯度醇沉，测定并比较各组分中总糖、蛋白质、糖醛酸及多酚的含量等理化指标，综合评价其对DPPH自由基、ABTS⁺自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力及总还原力；进一步通过Pearson相关性分析探讨苜蓿多糖理化性质与抗氧化活性之间的内在联系，初步建立其构效关系，为苜蓿多糖的高值化开发利用提供理论依据和参考。

（一）试剂与仪器

苜蓿，采自陕西省商洛市夜村镇，经商洛学院李筱玲副教授鉴定为紫花苜蓿；无水乙醇、苯酚、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸，天津市大茂化学试剂厂提供；浓硫酸（95%~98%），成都市科隆化学品有限公司提供；G-250型考马斯亮蓝，西安舟鼎国生物技术有限责任公司提供；十水合四硼酸硫钠，四川西陇化工有限公司提供；咔唑，天津市化学试剂三厂提供；1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（DPPH），上海源叶生物科技有限公司提供；抗坏血酸，中国食品药品检定研究院提供；2,2' -联氮-（3 -乙基苯噻唑啉- 6 -磺酸）（ABTS），美国Sigma公司提供。

UV-2501PC型紫外分光光度计，北京京科瑞达科技有限公司产品；FA2004型分析天平，上海恒平科学仪器有限公司产品；AnkeGL-16G-II型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器有限公司产品；LGJ- 10D型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司产品；M2型酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司产品。

（二）试验方法

1. 苜蓿多糖的制备

取自然风干的苜蓿200 g，捣碎；用95%乙醇回流脱脂3次，收集残渣，置通风橱中抽干。按照料液比1∶4加入蒸馏水，于90 ℃下连续搅拌提取3次（2 h /次）。提取液过滤后减压浓缩至原体积的1/3，加入乙醇并使终体积分数达 50%，于4 ℃下静置过夜，经离心、收集沉淀、冻干后得苜蓿多糖MSP- 50；将上清液中继续加入乙醇使终体积分数达 60%，于4 ℃静置过夜，经离心、收集沉淀、冻干后得苜蓿多糖MSP-60；按上述方法，上清液中依次加入乙醇使终体积分数为70%和 80%，得苜蓿多糖MSP- 70和MSP-80，置于干燥器中备用。

2. 总糖的测定

采用苯酚-硫酸法并稍作修改。准确称取各苜蓿多糖10 mg，加蒸馏水配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液。吸取0.1 mL置于试管中，加蒸馏水至1 mL；加入5%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，充分混合；于60 ℃水浴中反应10 min，冷却后于波长490 nm处测定吸光度；代入葡萄糖标准曲线的回归方程（Y=11.082 0X+0.114 5，R²=0.999）计算样品中总糖含量。

3. 蛋白质的测定

采用考马氏亮蓝法。吸取1.2.2中各苜蓿多糖溶液0.1 mL于试管中，加蒸馏水至1 mL，分别加入质量分数为0.01%的G-250型考马斯亮蓝溶液5 mL，混匀后于室温下放置5 min，立即于波长595 nm处测定吸光度，代入牛血清白蛋白标准曲线的回归方程（Y=6.279 3X+0.536 0，R²=0.995 8）计算样品中蛋白质含量。

4. 糖醛酸的测定

采用硫酸-咔唑法。吸取1.2.2中各苜蓿多糖溶液0.2 mL于试管中，加蒸馏水至1 mL，在冰浴中加入十水合四硼酸钠硫酸钠溶液6 mL，混匀后转移至沸水浴中20 min，取出放冷，加入0.2 mL咔唑溶液，混匀后放置2 h，于波长530 nm处测定吸光度，代入葡萄糖醛酸标准曲线的回归方程（Y=5.045 0X- 0.012 6，R²=0.999 8）计算样品中糖醛酸含量。

5. 多酚的测定

采用福林酚法。吸取1.2.2中各苜蓿多糖溶液1 mL，依次加入1 mL福林酚和质量分数为7.5%的Na₂CO₃ 0.8 mL，避光1 h，于波长765 nm处测定吸光度，代入多酚标准曲线的回归方程（Y=11.272 0X+ 0.133 6，R²=0.997 6）计算多酚含量。

6. 紫外光谱的测定

配制质量浓度为2 mg/mL苜蓿多糖溶液，于波长190~900 nm处进行紫外光谱扫描。

7. 抗氧化活性的测定

1）DPPH自由基清除能力测定。参考文献，分别取100 μL不同质量浓度（0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg/mL）苜蓿多糖溶液于5支试管中，加入100 μL浓度为0.1 mmol/L 的DPPH溶液，振荡摇匀后，避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度，每个质量浓度平行3次，以维C为阳性对照，按公式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：A₁——样品溶液的吸光度；

A₂——100 μL苜蓿多糖+ 50%乙醇溶液的吸光度；

A₀——100 μL纯水+ 100 μL DPPH溶液的吸光度。

2）羟自由基清除能力的测定。参照文献，分别取100 μL不同质量浓度（0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg/mL）苜蓿多糖溶液于5支试管中，加入100 μL浓度为9 mmol/L的FeSO₄·7H₂O溶液，接着加入100 μL浓度为2.4 mmol/L H₂O₂溶液，混匀后于37 ℃水浴中孵育10 min，加入100 μL新配置的浓度为9 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，混匀后继续于37 ℃水浴中孵育30 min，于波长510 nm处测定吸光度，每个质量浓度平行3次，以维C为阳性对照，按公式（2）计算羟自由基清除率。

式中：A₁——样品组的吸光度；

A₂——100 μL水代替6 mmol/L水杨酸乙醇溶液的吸光度；

A₀——100 μL纯水代替样品溶液的吸光度。

3）ABTS⁺自由基清除能力的测定。参考文献，稍作修改。避光条件下称取38.40 mg ABTS，制成浓度为7 mmol/L ABTS储备液。精密称取过硫酸钾10 mg加15 mL超纯水溶解制成过硫酸钾溶液，与ABTS储备液等比例混合，即得ABTS工作液。冷藏12 h后稀释至吸光度为0.70±0.02 后使用。取96孔板依次加入100 μL ABTS工作液和100 μL不同质量浓度（0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg/mL）苜蓿多糖溶液作为试验组（A₁）；以超纯水代替样品作为背景组（A₀）；以超纯水代替ABTS工作液为对照组（A₂）；避光反应30 min，于波长734 nm处测定吸光度。以维C为阳性对照，按照公式（3）计算清除率。

4）总还原能力的测定。参照文献，将2 mL不同质量浓度（0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg/mL）苜蓿多糖溶液、3.0 mL磷酸盐缓冲溶液（浓度0.2 mol/L，pH值6.8）和2.5 mL质量分数为1％的K3Fe（CN）6溶液充分混合，于45 ℃水浴中孵育 30 min，快速冷却后，向反应液中加入3.0 mL质量分数为10％的三氯乙酸溶液，混匀后以转速6 000 r/min离心10 min。取上清液3.0 mL，加入2.0 mL蒸馏水和1.0 mL质量分数为0.1％的FeCl3溶液，在室温下反应10 min后测定波长700 nm处的吸光度。以维C作为阳性对照。

5）超氧自由基清除能力的测定。采用邻苯三酚法，测定邻苯三酚自氧化速率时，将4.5 mL的Tris-HCl缓冲液（浓度50 mmol/L，pH值8.2）与4.2 mL纯水混合，于25 ℃下孵育20 min，快速加入0.3 mL邻苯三酚溶液（浓度3 mmol/L，用浓度10 mmol/L的盐酸配制，25 ℃预热），混匀后记录5 min内反应溶液在波长320 nm处的吸光度变化，绘制时间（t）-吸光度（A）的曲线。多糖作用下邻苯三酚自氧化速率的测定：4.5 mL的Tris-HCl缓冲液（浓度50 mmol/L，pH值8.2）与3.3 mL的纯化水混合，25 ℃下孵育20 min，快速加入0.9 mL不同质量浓度（0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg/mL）苜蓿多糖溶液及0.3 mL邻苯三酚溶液（浓度3 mmol/L，用浓度10 mmol/L盐酸配制，25 ℃预热），混匀后，记录 5 min内反应溶液于波长320 nm处的吸光度变化，绘制时间（t）-吸光度（A）曲线，在线性范围内计算反应物在单位时间内吸光度的改变，得出苜蓿多糖作用下的邻苯三酚的自氧化速率，按公式（4）计算超氧自由基的清除率。

式中：v₀——邻苯三酚的自氧化速率；

v——苜蓿多糖作用下邻苯三酚的自氧化速率。

8. 数据处理

试验采用平均值±标准差表示，使用Excel软件对试验数据进行整理，采用Origin 2024进行统计和作图分析。

（一）理化特征分析

1. 化学组成分析

苜蓿多糖中总糖、蛋白质、糖醛酸及多酚的含量见表1。

由表1可知，4种苜蓿多糖中总糖含量随乙醇体积分数的升高而增加，表明高体积分数乙醇更有利于沉淀和分离苜蓿多糖。蛋白质含量随乙醇体积分数升高而降低，其中MSP-50中蛋白质含量最高达（20.19±0.99）%，MSP-80中蛋白质含量最低为（3.01±1.13）%，这提示MSP-50中较多的糖蛋白被保留并形成了多糖蛋白缀合物，高体积分数乙醇有利于去除苜蓿多糖中蛋白质。糖醛酸和多酚的含量则随乙醇体积分数升高先降低后增加，在MSP-80时分别达最大为（5.39±1.01）%和（5.53±0.13）%。可见，高体积分数乙醇可富集苜蓿多糖中总糖和糖醛酸，但同时也引入了多酚类杂质。相较而言，MSP-70中多酚和蛋白质等杂质的含量较少，后期纯化较为容易，但其总糖和糖醛酸的含量也较少，可能是其活性较弱的原因之一。

2. 紫外光谱分析

苜蓿多糖的紫外光谱见图1。

由图1可知，4种苜蓿多糖在波长190~400 nm处均有明显的吸收，为多糖的典型特征吸收峰。同时，于波长280 nm处有吸收，且吸收强度的强弱顺序为MSP-50 > MSP-60 > MSP-70 > MSP-80，表明4种苜蓿多糖中均含有一定量的蛋白质，这与化学组成分析结果基本一致。苜蓿多糖紫外吸收曲线在波长200~400 nm处峰形的差异可能与多糖的分子结构有关，暗示乙醇醇沉的条件影响了苜蓿多糖的化学结构和理化性质。

（二）抗氧化活性分析

1. DPPH自由基清除能力

苜蓿多糖对DPPH自由基和羟自由基的清除能力见图2。

由图2（a）可知，质量浓度0.125~2.000 mg/mL时，4种苜蓿多糖对DPPH自由基的清除能力均随多糖质量浓度的增加而增强，且在0.250~1.000 mg/mL内与醇沉体积分数呈正相关，即MSP-80 > MSP-70 > MSP-60 > MSP-50。在质量浓度为2.000 mg/mL时，MSP-80对DPPH自由基的清除率最大为（70.48±1.03）%，其IC50为0.865 mg/mL，大于阳性对照维C（IC50为0.084 mg/mL），其次为MSP-70（IC50为2.194 mg/mL）、MSP-50（IC50为2.901 mg/mL）和 MSP-60（IC50为3.025 mg/mL）。其中MSP-50清除DPPH自由基强于MSP-60，可能是因为MSP-50中糖醛酸含量较高所致。

2. 羟自由基能力

由图2（b）可知，质量浓度为0.125~2.000 mg/mL时，4种苜蓿多糖MSP-80，MSP-70，MSP-60和MSP- 50对羟自由基的清除能力均随多糖质量浓度的增加而增强。在质量浓度为2.00 mg/mL时达最大，分别为（82.65±0.99）%，（69.92±1.05）%，（56.17±1.31）%和（78.76±0.96）%，其IC50值分别为0.150，0.602，1.228和0.905 mg/mL，其中MSP-80的IC50值几乎逼近于阳性对照维C（0.142 mg/mL）。另外，在低质量浓度（0.125 mg/mL）时，4种苜蓿多糖对羟自由基的清除能力均强于阳性对照维C，其强弱顺序为MSP-80 > MSP-70 > MSP-60 > MSP-50 > 维C。这表明4种苜蓿多糖均有潜力被开发用作自由基清除剂或是天然抗氧化剂。

3. ABTS⁺自由基清除能力

苜蓿多糖对ABTS+自由基清除能力和总还原力见图3。

由图3（a）可知，质量浓度为0.125~2.000 mg/mL时，4种苜蓿多糖对ABTS+自由基的清除能力较强，均随样品质量浓度的增加而呈上升趋势，在质量浓度2.000 mg/mL时达最大，其强弱顺序为MSP-80≈MSP-70≈MSP-60≈维C > MSP-50。当质量浓度为0.250~1.000 mg/mL时，4种苜蓿多糖对ABTS+自由基的清除能力强弱顺序为维C > MSP-80 > MSP-70 > MSP- 50 > MSP-60。当质量浓度为0.125 mg/mL时，MSP- 80清除ABTS+自由基的能力最强（IC50为0.009 mg/mL），且强于阳性对照维C（IC50为0.011 mg/mL），其次为MSP-70，MSP-60和MSP-50。这说明较高体积分数乙醇醇沉苜蓿多糖有利于提升其对ABTS+自由基的清除能力，可能与高体积分数乙醇更易于富集总糖、糖醛酸及多酚有关。

4. 总还原能力分析

由图3（b）可知，在较低质量浓度时，4种苜蓿多糖的还原能力较强，且与阳性对照维C的差异较小。但随着质量浓度的增加，4种苜蓿多糖的还原能力逐渐与阳性对照维C的差异增大。然而，4种苜蓿多糖仍然表现出了一定的还原能力，且随质量浓度的升高而增强。在质量浓度为2.000 mg/mL时，4种苜蓿多糖还原力大小为MSP-80 > MSP-70 > MSP-60 > MSP-50，这可能与MSP-80中总糖、糖醛酸和多酚的含量最高有关。

5. 超氧自由基清除能力

苜蓿多糖对超氧自由基的清除能力见图4。

由图4可知，随着质量浓度的升高（0.125~ 2.000 mg/mL），4种苜蓿多糖清除超氧自由基的能力整体上升，并趋近于阳性对照维C。在质量浓度为2.000 mg/mL时，4种苜蓿多糖清除超氧自由基强弱顺序为维C > MSP-80 >   MSP-70 > MSP-50 > MSP-60，与ABTS+自由基清除能力和总还原能力趋势相似，MSP-80 的IC50为0.618 mg/mL，大于阳性对照维C（0.080 mg/mL）。在质量浓度为0.250~1.000 mg/mL时，MSP-50对超氧自由基的清除能力逐渐增强并在质量浓度为1.000 mg/mL时超过其他3种苜蓿多糖；MSP- 60 对超氧自由基的清除能力起始大于 MSP-70和MSP- 80，随后逐渐降低并在1.000 mg/mL时约等于MSP- 80但略大于MSP-70。但在质量浓度为0.125 mg/mL时，4种苜蓿多糖清除超氧自由基的强弱顺序为MSP-70 > MSP-80 > MSP-50 > MSP-60。这种变化可能是4种多糖的化学组成及结构特性不同所致，具体机制有待进一步研究。

（三）相关性分析

MSP-50，MSP-60，MSP-70和MSP-80的相关性分析见图5。

借助Pearson相关性分析初步分析了苜蓿多糖抗氧化活性与其理化性质之间的关系。MSP-50对DPPH自由基、羟自由基、总还原能力、ABTS+自由基及超氧自由基的清除率与总糖、蛋白、糖醛酸和多酚的含量之间均呈显著性正相关（p<0.05）。MSP-50中总糖最低，但蛋白质最高、糖醛酸仅次于MSP-80，多酚中等，因此其抗氧化活性中等，这与2.2抗氧化活性的测定结果基本一致。MSP-60中总糖、糖醛酸、蛋白质和多酚的含量与DPPH自由基、羟自由基、总还原力、ABTS⁺自由基及超氧自由基的清除率亦呈显著性正相关（p<0.05）。MSP-60中总糖含量较MSP-50高，但糖醛酸和蛋白质的含量较低，同时多酚最低，这也是MSP-60抗氧化活性较弱的主要原因。MSP-70中总糖、糖醛酸、蛋白质和多酚的含量均与DPPH自由基、羟自由基、总还原能力、ABTS⁺自由基及超氧自由基的清除率呈显著性正相关（p< 0.05）。MSP-70中总糖含量接近于MSP-80，但其糖醛酸最低，蛋白质和多酚的含量也较低，可能是其抗氧化活性较低的重要原因。MSP-80 中总糖、糖醛酸和多酚的含量与DPPH自由基、羟自由基、总还原能力、ABTS⁺自由基及超氧自由基的清除率呈显著性正相关（p<0.05），与蛋白质含量呈弱的正相关（p> 0.05）。MSP-80 中蛋白含量最低，总糖、糖醛酸和多酚的含量最高，这可能是MSP-80总体抗氧化活最强的主要原因。以上分析说明，较高含量的总糖和糖醛酸及较低含量的蛋白质是苜蓿多糖发挥抗氧化活性的关键。总糖可能通过增加活性位点数量或提升其水溶性，增强其与自由基的反应能力。糖醛酸作为酸性基团，可通过提高多糖水溶性、螯合金属离子或直接参与自由基清除反应，增强其抗氧化活性。然而，蛋白质-多糖复合物的形成可能通过改变多糖空间结构，间接影响其抗氧化活性，具体机制有待进一步研究。