海棠果（Malus prunifolia）是一种营养丰富的水果，富含维C、膳食纤维、糖类、蛋白质、矿物质、有机酸、脂类物质和多种生物活性成分（如类黄酮、多酚和根皮苷等）。研究表明，海棠果具有生津止渴、健脾止泻、抗疲劳和增强免疫力等功效，其生物活性与其所含的多糖、多酚等成分密切相关。多糖作为海棠果的主要活性成分之一，具有抗氧化、免疫调节、抗炎等多种生理功能。

近年来，海棠果产业面临诸多发展瓶颈，集中表现为果实成熟窗口期短，导致大量未及时采收的果实损耗，同时冷链物流体系不完善，运输成本居高不下，严重制约产业的规模化发展。目前，行业仍以初级加工为主，产品主要局限于传统果酒、发酵果醋、浓缩果汁、果糕等低附加值品类。值得注意的是，随着大健康产业的蓬勃发展，消费者对功能性食品的需求逐年增长，而针对海棠果高值化精深加工的研究尚属空白。

熟成黑化技术作为果蔬加工领域的前沿方向，其创新之处在于通过阶梯式温控工艺诱导美拉德反应的级联效应，将新鲜果蔬转化为富含生物活性物质的黑色食品体系。研究表明，该技术不仅可保留果蔬的天然风味物质，还能显著增强功能成分的活性。以黑海棠果为试验材料，优化黑海棠果多糖（MBP）的提取工艺，并分析其结构，为海棠果高值化加工技术革新和全产业链升级提供了科学依据与工艺范式。

（一）材料与试剂

浓硫酸，沈阳化学试剂厂提供；5%苯酚水溶液，深圳市必达环保科技有限公司提供；氨基磺酸，山东科源生化有限公司提供；氢氧化钾，辽宁泉瑞试剂有限公司提供；氢氧化钠，天津永晟精细化工有限公司提供；间羟基联苯，信瑞诺医药有限公司提供；三氯乙酸，上海吉至生化科技有限公司提供；G-250型考马斯亮蓝，天津市科密欧化学试剂开发中心提供；牛血清白蛋白（BSA），福州飞净生物科技有限公司提供；磷酸，沈阳华东试剂厂提供；牛血清白蛋白，上海易汇生物科技有限公司提供；葡萄糖，天津市大茂化学试剂厂提供。

（二）仪器与设备

Epoch型酶标仪，美国BioTek公司产品；CP-114型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司产品；HH-4D型电热恒温水浴锅，上海比朗仪器有限公司产品；CT15RT型台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司产品；KQ3200B型提取波清洗器，昆山市提取仪器有限公司产品；磁力搅拌器，上海一恒科学仪器有限公司产品；DHG-9070A型鼓风干燥箱，上海飞跃实验仪器有限公司产品；变频式恒温恒湿试验箱，东莞市力显仪器科技有限公司产品；LG型食品型冷冻干燥机，北京松源华兴生物技术有限公司产品；UV-2401型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司产品；Nicoleti S20型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Fisher公司产品；KQ5200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

（三）试验方法

1. 黑海棠果的制作

将初筛的新鲜海棠果洗净后装入耐高温塑料袋中密封，加入13%蔗糖并充分混匀。随后，将样品置于变频式恒温恒湿试验箱中，按设定程序处理7 d，待果实变为黑褐色后取出。接着，将果实置于烘干箱中干燥，使含水量降至30%左右，最终制得黑海棠果成品。制备完成的样品在4 ℃下保存，备用。

2. 黑海棠果多糖提取率的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖提取率。建立葡萄糖标准曲线，以系列质量浓度葡萄糖标准溶液为横坐标，以各溶液在波长490 nm处的吸光度（OD值）为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程。样品测定时，取黑海棠果多糖提取液，于波长490 nm处平行测定3次吸光度。若样品吸光度超出标准曲线线性范围，则用蒸馏水适当稀释后重新测定，确保测定结果在标准曲线适用范围内。得到标准曲线方程为Y=0.000 6X+0.074 4，R²=0.995 4。

多糖提取率计算公式如下：

3. 单因素试验

在精确称取黑海棠果1.5 g，超声功率300 W的基准条件下，固定料液比1∶30（g∶mL），提取温度60 ℃，设置5个提取时间梯度15，30，45，60，75 min；固定料液比1∶30，提取时间45 min，设置5个提取温度梯度40，50，60，70，80 ℃；固定提取温度60 ℃，提取时间45 min，设置5个料液比梯度 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g∶mL），考查提取时间、提取温度和料液比对黑海棠果多糖提取率的影响，所有试验均设置3次重复。

4. 正交试验

在单因素试验基础上，采用提取温度、提取时间和料液比这3个较好的水平进行L₉（3⁴）正交试验。

正交试验因素与水平见表1。

5. 黑海棠果多糖提取纯化

1）多糖提取。采用优化后的提取工艺制得多糖提取液，经80 ℃旋转蒸发浓缩后，加入食用乙醇至终体积分数为80%，使多糖沉淀，经冷冻干燥后获得黑海棠果粗多糖。

2）蛋白质脱除。取10 g粗多糖冻干粉溶于500 mL蒸馏水中，加入270 mL质量分数为20%的三氯乙酸溶液，于摇床中振荡溶解3 h后静置20 min，离心收集上清液。重复上述操作3次，通过测定脱蛋白前后蛋白质及多糖含量，计算蛋白脱除率和多糖损失率。最后，将脱蛋白溶液透析处理并冷冻干燥，获得纯化多糖。

6. 蛋白质含量测定

参照李欣琪等人方法并稍作修改。

1）溶液的配制。①考马斯亮蓝的配制：使用分析天平（精度为0.1 mg）称取G-250型考马斯亮蓝固体（50.0±0.5）mg，加入25 mL质量分数为95%色谱纯，以乙醇为溶剂，采用磁力搅拌协同提取辅助溶解，恒温滴定装置逐滴加入50 mL质量分数为85%的H₃PO₄溶液，混合保持固定料液比，将混合液转移至500 mL棕色瓶中，于4 ℃下避光静置，经过滤后备用。②BSA标准溶液的配制：首先，配制母液0.125 g BSA + 25 mL水得到质量浓度为5 mg/mL的BSA储备液，取母液1 mL，水100 mL稀释成质量浓度为50 μg/mL的溶液备用。

2）标准曲线制备。按照梯度吸取BSA储备液，以质量浓度为50 μg/mL的BSA母液为基准，分步精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL至EP管中，采用蒸馏水补足至终体积1.0 mL，获得0，10，20，30，40，50 μg/mL的蛋白质量浓度梯度。向各梯度管中快速注入 4.0 mL预冷的考马斯亮蓝显色液，将各管置于涡旋振荡器（转速2 500 r/min，时间10 s），实现液层充分混匀。 避光条件下室温孵育5 min（计时误差±30 s），促使染料-蛋白复合物稳定生成。于波长595 nm处检测。所得标准曲线方程为Y=0.004 6X+ 0.345 6，R²=0.998 4。

3）蛋白质含量测定。称取样品10 mg，加水稀释至250 mL，按标准曲线方法取样测定。

7. 紫外-可见光谱分析

将纯化后的黑海棠果多糖溶液置于紫外-可见分光光度计中于波段190~400 nm进行全波长光谱扫描（分辨率1 nm，扫描速率120 nm/min）。

8. 红外-可见光谱分析

取纯化的黑海棠果多糖样品0.5 mg，与光谱纯KBr 150 mg经精确混合，先采用玛瑙研钵预粉碎，再结合球磨机研磨压成薄片，红外光谱扫描仪于波数4 000~400 cm-1内对压片进行分析。

9. 扫描电镜测试

称取10 mg干燥的黑海棠果多糖样品，于5 kV加速电压下进行电子显微镜扫描，采用SEM分别观察100，50 μm下的黑海棠果多糖形貌。

（四）数据处理

采用SPSS 23.0进行正交试验设计和单因素方差分析，采用Origin 2021进行绘制。

（一）单因素试验结果

1. 提取时间对黑海棠果多糖提取率的影响

提取时间对黑海棠果多糖提取率的影响见图1。

提取时间是影响多糖提取率最重要的因素之一。由图1可知，随着提取时间的延长，提取率呈先上升后下降的趋势，当提取时间为45 min时，多糖提取率达到最大值，这是因为当提取时间较短时，海棠果细胞壁未能充分破碎，有效成分溶出不完全，因而多糖提取率较低；随着提取时间的延长，提取作用增强，细胞膜结构进一步破坏，促进了细胞内多糖的释放，从而提高了多糖提取率；当提取时间超过45 min，多糖提取率下降，可能是由于剧烈的空化效应引起多糖分子链断裂，部分多糖发生降解所造成。

2. 提取温度对黑海棠果多糖提取率的影响

提取温度对黑海棠果多糖提取率的影响见图2。

由图2可知，多糖提取率随着提取温度的升高呈先上升后下降的趋势，这是因为随着提取温度的升高，增强了分子热运动，破坏了内部细胞，促进多糖分子的扩散和溶解，从而提升溶出效率。当提取温度为60 ℃时，多糖提取率最高，为（11.41±0.16）%。随着提取温度的进一步升高，多糖提取率下降，这是因为较高温度与提取波的协同作用会破坏多糖结构。因此，确定提取温度在正交试验中的因素水平为50，60，70 ℃。

3. 料液比对黑海棠果多糖提取率的影响

料液比对黑海糖果多糖提取率的影响见图3。

料液比能够优化提取过程中的渗透压平衡，促进细胞内多糖向提取介质中高效转移，这是提升多糖提取率的关键工艺参数之一。由图3可知，黑海棠果多糖提取率随着料液比的增大呈先上升后下降的趋势，这可能是由于随着料液比的增大，溶剂体积增加，体系黏度因稀释作用而下降，导致分子运动阻力减小，从而加速多糖的扩散和溶出，提高提取率。当料液比为1∶20时，提取率为（11.87±0.08）%；当料液比为1∶50时，多糖提取率为（9.86±0.11）%，此时由于细胞内外的多糖质量浓度差消失，溶出达到平衡，多糖提取率不再上升。因此，确定料液比在正交试验中的因素水平为1∶10，1∶20，1∶30。

（二）正交试验结果

正交试验设计及结果见表2，正交试验方差分析结果见表3。

通过分析R值得出，3个因素对黑海棠果多糖提取率影响大小次序为料液比（C）>提取温度（B）>提取时间（A）。其中，因素C对黑海棠果多糖提取率的影响极显著（p<0.01），因素B对黑海棠果多糖提取率的影响显著（p<0.05），因素A对黑海棠果多糖提取率的影响不显著（p>0.05）。由K值可知，最佳工艺为A₃B₂C₁，综合多糖提取率、可操作性与经济性等方面因素，选择最佳提取工艺为正交试验中的第8组，即提取时间60 min，提取温度60 ℃，料液比1∶10。

（三）验证试验

按照A₃B₂C₁组合试验3次，黑海棠果多糖的平均提取率为（12.66±0.21）%，高于正交试验中其他组合，证实该工艺试验效果较好。

（四）脱蛋白前后成分含量对比分析

通过对比发现，脱蛋白前黑海棠果多糖的总糖为（91.3±0.52）%，蛋白质为（0.17±0.02）%。脱蛋白后，总糖为（45.19±0.61）%，蛋白质为（0.027±0.005）%，黑海棠果多糖蛋白脱除率为84.12%，多糖损失率为53.55%，说明三氯乙酸法脱蛋白明显，但是多糖损失较多。这可能是由于三氯乙酸是一种有机酸且酸性较强，在沉淀蛋白质的同时使多糖降解。

脱蛋白前后成分含量对比分析见表4。

（五）MBP的紫外光谱分析

利用紫外-可见分光光度法对多糖样品进行全波长扫描分析。由于核酸和蛋白质分别于波长260 nm和280 nm处具有特征性吸收峰，通过检测这2个波长附近的吸光度，可判断多糖样品中是否残留游离的核酸或蛋白质杂质。

MBP紫外扫描光谱分析见图4。

由图4可知，在紫外波长280 nm处多糖溶液有吸收峰，表明MBP含有蛋白质而不含核酸，MBP样品中可能含有某些干扰性杂质，这些杂质阻碍三氯乙酸对蛋白质的完全沉淀或使其变性，从而导致脱蛋白不完全。

（六）MBP的红外光谱分析

黑海棠果多糖红外光谱图见图5。

红外光谱可用于分析多糖的功能基团组成及糖苷键构型等结构特征。黑海棠果样品的红外光谱分析结果表明，波数3 427 cm-1处强宽峰为O-H伸缩振动，波数2 929 cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动，二者均为多糖的特征吸收峰，表明样品含多糖类成分；波数1 619 cm-1与波数1 441 cm-1的吸收峰存在- COO -中C = O不对称和对称拉伸振动，证实存在羧基官能团。波数1 743 cm-1酯羰基峰提示可能含糖醛酸甲酯，说明多糖可能为酸性多糖；波数1 101，1 052，1 019 cm-1处吡喃糖环C-O-C糖苷键振动峰，结合1 019 cm-1处强峰，可推断多糖以吡喃环构型为主。波数832 cm-1芳香环C-H面外弯曲振动峰则提示可能伴随酚类等共存成分。综上，红外光谱证实黑海棠果中多糖为含羧基的吡喃环型酸性多糖。

（七）MBP微观表面形态分析

MBP扫描电镜图见图6。

从微观表面形态来看，黑海棠果多糖整体呈现出片层状与纤维状交织的不规则块状结构。低倍视野下，可见较多大小不一的团聚体，表面粗糙且存在明显的褶皱与沟壑，推测可能是由于多糖分子间通过氢键、范德华力等相互作用形成的聚集态结构。高倍视野下，团聚体表面可观察到大量平行排列的纤维状或带状结构，纤维直径约为数百纳米，且部分区域呈现出卷曲或堆叠特征，这与酸性多糖（如果胶、透明质酸）的典型微观形态相似。此外，样品表面存在一定数量的孔隙结构，可能是干燥过程中水分挥发所形成，这种多孔结构可能与其较高的持水性和吸附性相关。