软儿梨，别名冻梨、香水梨，是甘肃特色水果。秋冬季采摘的果实浆汁多、味甜，富含多种营养成分，具有清热止咳、润肺醒酒等功效，但受加工和储运限制，产业发展受阻。甘草是我国大宗药材，被广泛应用于食品、医药等领域，有抗氧化、抗炎和保肝等特性。

食用酵素是指以植物为原料，经微生物发酵制备的含有特定生物活性成分的可食用酵素产品。当前，酵素产品主要聚焦于生产工艺优化与功能活性评价两大领域。韩欣悦等人以感官评分为指标，通过单因素试验和正交试验优化了牛蒡根果蔬复合酵素的发酵工艺。在功能研究领域，食叶草酵素可通过提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）活力，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平，改善乙醇诱导的HepG2细胞损伤。此外，刺梨酵素化果醋能够改善酒精诱导的急性肝损伤小鼠的肝脏氧化应激状况。

酵素食品研究在我国尚仍处于相对早期阶段，表现为产品种类不够丰富且知名品牌较少。因此，开发植物酵素产品至关重要。以甘肃皋兰软儿梨为原料，用植物乳杆菌发酵制成软儿梨酵素饮料，复配甘草浸提液制得软儿梨甘草复合酵素饮料，为软儿梨与甘草的开发利用提供理论支持。

（一）材料与试剂

甘肃皋兰产优质软儿梨、甘草、白砂糖，均为市售；植物乳杆菌，陕西瑞茂生物科技有限公司提供；SOD试剂盒、ADH试剂盒、1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。

（二）仪器与设备

AL204型电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司产品；DM0412型离心机，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司产品；HH-6型水浴锅，常州市亿能实验仪器厂产品；DHP-9160B型培养箱，上海琅玕实验设备有限公司产品；V-1100D SPECTROP- HOTOMETER型分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品。

（三）试验方法

1. 软儿梨梨汁和甘草浸提液的制备

将软儿梨洗净，去梗、去皮、切块，打浆、装盒，按料液比3∶7（g∶mL）加无菌水制成梨汁，备用。将甘草磨粉后与无菌水按料液比1∶40（g∶mL）混合，搅拌后预浸10 min，在90 ℃下浸提2次（每次90 min），合并滤液得甘草浸提液。

2. 软儿梨酵素饮料制备工艺流程

原材料预处理→梨块打浆→添加辅料→发酵→巴氏杀菌→灌装→成品。

（四）软儿梨酵素饮料制备工艺优化

1. 软儿梨酵素饮料单因素试验

选取白砂糖添加量（3%，5%，7%，9%，11%）、发酵温度（28，31，34，37，40 ℃）、植物乳杆菌添加量（0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%）和发酵时间（12，24，36，48，60 h）为单因素试验的变量，以感官评分作为评价指标，考查各因素对软儿梨酵素饮料品质的影响。

2. 软儿梨酵素饮料正交试验

在单因素试验基础上，以白砂糖添加量（A）、发酵温度（B）、植物乳杆菌添加量（C）和发酵时间（D）为因素，以感官评分为指标，采用正交试验确定最佳制备工艺。

正交试验因素与水平见表1。

3. 软儿梨酵素饮料感官评价

感官评价时，邀请20名相关专业人员（10男10女）组成评价小组，成员需身体健康，具备较强的感官分辨能力。

感官评分标准见表2。

（五）软儿梨甘草复合酵素饮料制备

在软儿梨酵素饮料最佳制备条件下，分别按体积的5%，10%和15%添加甘草浸提液，制备软儿梨甘草复合酵素饮料，结合感官评分，确定其最佳制备条件。

（六）功能性测定

1. SOD活力的测定

按SOD试剂盒说明书，设定对照管和测定管，加入相应试剂液于离心管中，在37 ℃下水浴40 min后加显色剂，混匀后静置10 min，蒸馏水调零，于波长550 nm，光径1 cm处测吸光度。按公式（1）计算SOD活力。

式中：A1——对照管吸光度；

    A2——测定管吸光度。

2. DPPH自由基清除率的测定

按DPPH自由基清除能力试剂盒说明书，设定对照管、测定管和空白管，按照操作表加样本液等并混匀，在25 ℃下避光静置30 min，以转速4 000 r/min离心5 min，取800 μL置于比色皿中，用无水乙醇调零，于波长517 nm处测定吸光度。按说明制备质量浓度为0.5 mg/mL的（Trolox）标准应用液，用体积分数为80%甲醇分别稀释成质量浓度为5，10，15，20，25 μg/mL的标准液，同样条件静置后，于波长517 nm，光径1 cm处测吸光度。按公式（2）和（3）计算DPPH自由基清除率。

式中：A1——分别为测定管吸光度；

A2——对照管吸光度；

A3——空白管吸光度；

A（S）——各质量浓度标准管吸光度；

A（S0）——标准质量浓度0时的吸光度。

3. ADH活力的测定

按ADH试剂盒说明书，设定空白管和测定管，加相应试剂液混匀，于37 ℃下预温10 min，分别加双蒸水和饮料原液并计时，15 s时于波长340 nm，光径0.5 cm处测OD值A1，迅速放回37 ℃水浴，20 min 15 s时测OD值A2；加双蒸水重复操作得空白OD值A1和A2。按公式（4）计算ADH活力。

式中：A测定1——测定管15 s的吸光度；

A测定2——20 min 15 s的吸光度；

A空白1——空白管15 s的吸光度；

A空白2——空白管20 min 15 s的吸光度。

（七）数据分析

所有试验数据均为3次重复试验的平均值，采用SPSS 26软件和Graphpad prism 9等软件分析数据并制图。

（一）软儿梨酵素饮料单因素试验结果分析

各因素对软儿梨酵素饮料感官评分的影响见图1。

由图1（a）可知，白砂糖添加量对感官评分的影响呈先上升后下降趋势。白砂糖添加量为3%时，色泽浅白、发酵香味微弱，评分较低；白砂糖添加量为7%时，甜酸适中、色泽金黄、组织状态均匀，评分最高；白砂糖添加量增至9%和11%时，可能因甜度过高掩盖天然风味，口感下降。因此，白砂糖添加量选定为5%，7%，9%。

由图1（b）可知，发酵温度对感官评分的影响呈先上升后下降趋势。发酵温度为28 ℃时，发酵缓慢，风味寡淡；发酵温度为34 ℃时，酸甜适中、梨香味浓郁，评分最高；发酵温度超过37 ℃后，可能发酵液中菌活性受抑制，评分下降。因此，发酵温度选定为31，34，37 ℃。

由图1（c）可知，植物乳杆菌添加量对感官评分的影响呈先上升后下降趋势。植物乳杆菌添加量为0.6%时，酸甜可口、色泽金黄、组织均匀，评分最高；植物乳杆菌添加量超过0.9%时，可能植物乳杆菌大量繁殖引起酸度过高[15]，评分下降。因此，植物乳杆菌添加量选定为0.3%，0.6%，0.9%。

由图1（d）可知，发酵时间对感官评分的影响呈先上升后下降趋势。发酵时间为12 h时，风味偏淡；发酵时间为24 h时，酸甜适中、梨香明显、色泽均匀，评分最高；发酵时间超过24 h后，酸味过重，评分下降。因此，发酵时间选定为12，24，36 h。

（二）正交试验结果分析

正交试验结果见表3。

经过正交试验极差R可知，4个因素的主次顺序为B>A>C>D，即发酵温度>白砂糖添加量>植物乳杆菌添加量>发酵时间。由K值可知，最优组合为A2B2C3D2，即白砂糖添加量7%，发酵温度34 ℃，植物乳杆菌添加量0.9%，发酵时间24 h。

（三）验证试验

经验证，最佳组合下制备的软儿梨酵素饮料感官评分为95.10分，与正交试验结果相近。

（四）软儿梨甘草复合酵素饮料制备最佳条件的确定

在最佳组合条件下制备软儿梨酵素饮料后，分别向其中添加体积占比为5%，10%和15%的甘草浸提液。经感官品评分析，当甘草浸提液添加体积为10%时，所得复合酵素饮料的口感风味协调。此外，综合经济因素，最终确定甘草浸提液的最适添加量为软儿梨酵素饮料体积的10%，得到软儿梨甘草复合酵素饮料的最佳制备条件。

（五）软儿梨甘草复合酵素饮料功能性成分测定

功能性成分测定显示，该复合酵素饮料的SOD活力为53.75 U/mL，DPPH自由基清除率为65.92%，ADH活力为4.98 U/mL。