豆腐是我国的传统食品，至今已有2 000 多年的历史，素有“植物肉”之美称，深受人们喜爱。豆腐通常以大豆为原料，经浸泡、磨浆、 煮浆、点浆等工序制成，其富含人体所需的多种微量元素和优质蛋白，氨基酸组成和结构与肉类相似，既是东亚国家的日常膳食，也越来越受到西方国家的关注。

豆腐作为一种大豆蛋白凝胶制品，传统生产中通常以盐卤、石膏粉为凝固剂，若操作不当，容易影响成品口感和质地。以酶类作为凝固剂，不仅通过提高蛋白质的发泡性、乳化性、热稳定性和凝胶能力等改善食品的风味、口感、质地和外观等，还能降低长期食用的安全风险。因此，研发以酶为凝固剂的豆腐生产工艺，对豆制品产业的发展具有重要意义。以豆浆为原料，探究凝固酶对大豆蛋白凝胶产品相关性质的影响，以期为豆制品点浆工艺凝固剂的选择提供参考依据。

（一）材料与试剂

谷氨酰胺转氨酶（TG 酶）、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司提供；碱性蛋白酶，南宁东恒华道生物科技有限责任公司提供；大豆，邵阳 A 厂家提供。

（二）仪器与设备

6227001 型离心机，Dynamica 公司产品； TA1SH-230V-CNAU型质构仪，美国 AMETEK 公司产品；DZKW-4型电热恒温水浴锅，北京中兴伟业世纪仪器有限公司产品；离心管，规格为 10 mL。

（三）试验方法

1.   工艺流程

2.   凝胶品质的检测

1）感官评价。分别请 20 名食品专业的学生，按照GB/T 10221—2021标准采用百分制， 从色泽、质地、滋味和气味4个方面对所得的凝胶样品进行感官评价。

感官评分标准见表 1。

2）持水率。称取一定质量的凝胶样品装入 10 mL 离心管中，在4℃下以转速10 000 r/min 离心10~ 15 min，将离心管倒置，用滤纸小心吸出离心后样品沥出的水分，称取质量。按公式 （1）计算持水率。

3）质构检测。采用质构仪对凝胶样品硬度、弹性、黏度等进行测定和分析。在凝胶样品中部取样，尽量使样品表面平整，高度为1 cm， 然后利用质构分析仪进行测定。测试条件为测试前速度2.00 mm/s，测试中速度 2.00 mm/s， 测试后速度 2.00 mm/s，压缩比 30%，2 次间隔 3.00 s，压力设置 5.0 g。试验重复 3 次后取平均值，然后进行数据处理。

4）色差。采用色差仪测定样品的亮度 （L^*值）。测定前用标准白板校正仪器，每个样品测定 3 次，取平均值。

3.   单因素试验设计

1）酶种类。设定酶添加量为 0.8%，点浆温度为 60 ℃，蹲脑时间为 25 min，分别向 4 份豆浆中加入TG酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、 中性蛋白酶，对所制作的凝胶样品进行感官评分和品质测定。

2）酶添加量。设定点浆温度为60℃，蹲脑时间为25 min，分别向5份豆浆中加入0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的 TG 酶，对所制成的凝胶样品进行感官评分和品质测定。

3）点浆温度。设定酶种类为 TG 酶，酶添加量为 0.8%，蹲脑时间为 25 min，点浆温度分别为45，50，55，60，65 ℃，对所制成的凝胶样品进行感官评分和品质测定。

4）蹲脑时间。设定酶种类为 TG 酶，酶添加量为 0.8%，点浆温度为 60 ℃，蹲脑时间分别为15，20，25，30，35 min，对所制成的凝胶样品进行感官评分和品质测定。

4.   响应面试验设计

根据单因素试验，利用 Design Expert 软件进行响应面优化设计，设计三因素三水平的响应面试验。

（一）单因素试验结果

1.   酶种类对感官评分和品质的影响

酶种类对凝胶质构的影响见图 1，酶种类对凝胶感官评分、亮度的影响见图 2，酶种类对凝胶持水率的影响见图 3。

TG 酶处理的凝胶在弹性和黏聚性方面表现较好，表明其能有效促进大豆蛋白交联形成紧密有序的凝胶网络；木瓜蛋白酶处理的凝胶硬度最低，可能因在试验条件下对大豆蛋白的结构调控能力较弱；碱性蛋白酶和中性蛋白酶的质构指标介于二者之间，显示出中等水平的凝胶强度。 在感官评分方面，TG 酶组的感官评分最高，其凝胶色泽均匀、呈淡黄色且有光泽，质地完整、弹性适中，滋味纯香、豆香味浓郁；中性蛋白酶组感官评分最低，可能与其凝胶质地松散、豆香味较淡有关。亮度方面，各组酶处理下的凝胶并无明显差异。TG 酶组持水率最高，其形成的凝胶网络孔隙均匀，能有效截留水分；碱性蛋白酶组持水率最低，可能因其凝胶网络疏松，水分易渗出。综合质构、感官评分和持水率结果，TG 酶作为凝固酶时凝胶品质最佳。因此，选择其作 为后续单因素试验和响应面试验的固定酶种类。

2.   酶添加量对感官评分和品质的影响

酶添加量对凝胶质构的影响见图 4，酶添加量对凝胶感官评分、亮度的影响见图 5，酶添加量对凝胶持水率的影响见图 6。

随着酶添加量的增加，凝胶产品在黏聚性、 硬度和亮度呈现了一个不断增长的趋势，而弹性、持水率和感官评分这3个方面是呈现了一个先增长后降低的趋势，这可能与酶的水解速度和大豆蛋白展开形成凝胶速度有关。当酶添加量小于0.8%时，酶活较低，水解程度低，大豆蛋白不能达到形成凝胶的最佳展开程度，形成的凝胶强度较低，黏聚性、硬度、亮度、弹性、持水率和感官评分都较低；而当酶添加量大于0.8%时， 酶活较高，水解速度快，展开的大豆蛋白被降解为短肽而不能形成很好的凝胶，导致弹性、持水率和感官评分都较低；当酶添加量为0.8%时， 酶的水解速度与大豆蛋白展开形成凝胶的速度相适应，能够形成较好的凝胶，弹性、持水率、 感官评分达到了最大值，分别为 0.862， 68.9%和 96 分。

3.   点浆温度对感官评分和品质的影响

点浆温度对凝胶质构的影响见图 7，点浆温度对凝胶感官评分、亮度的影响见图 8，点浆温度对凝胶持水率的影响见图 9。

随着点浆温度的升高，所得凝胶产品的硬度、持水率和感官评分呈先增加后下降的趋势， 弹性和黏聚性的变化无显著差异，亮度不断降低。当点浆温度为 60 ℃时，凝胶的硬度、持水率和感官评分达到了最高值，分别为 394.654 g，69.9%和 96 分。这是因为随着点浆温度的升高，大豆蛋白内部的疏水键暴露速度逐渐加快，肽链迅速交联形成凝胶；当点浆温度超过最适温度时，分子运动速度加快，所形成的凝胶不稳定。

4.   蹲脑时间对感官评分和品质的影响

蹲脑时间对凝胶质构的影响见图 10，蹲脑时间对凝胶感官评分、亮度的影响见图 11，蹲脑时间对凝胶持水率的影响见图 12。

随着蹲脑时间的延长，凝胶产品在硬度和亮度上呈上升趋势，在弹性、感官评分和持水率上则呈先上升后下降的趋势，而黏聚性呈现出不显著的下降趋势。根据所得数据，可能是在蹲脑过程中，TG 酶和蛋白质分子进行了一定的反应， 随着蹲脑时间的延长，凝胶的各个指标达到了一个稳定值。因此，适合 TG 酶的蹲脑时间为 25 min。

（二）响应面试验设计及结果

1.   响应面试验结果与显著性分析

利用 Design Expert 软件进行响应面优化设计，设计三因素三水平的响应面试验。响应面试验因素与水平见表 2，响应面试验方案及结果见表 3，回归方程方差分析见表 4。

根据 Box-behnken 的中心组合试验设计方法，对试验的结果进行回归拟合，得到二次多项回归模拟方程：

由表 4可知，回归模型p=0.000 2<0.01， 表明模型达到了极显著的水平，且模拟失拟项 p=0.615 1> 0.05，则表明失拟项差异不显著， 所以回归模型有效。相关系数 R2 =0.97，R2 adj=0.93，表明该模型拟合程度较好。通过方差分析中 F 值的判断比较，可得出 3 个因素对感官评分的主次顺序为酶添加量（A）> 点浆温度（B）> 蹲脑时间（C）。

2.   响应面验证试验

各因素交互作用影响的响应面见图 13。

由图 13 可知，3D 图坡度的陡峭程度也可反映 其对响应值的影响程度，即坡度越陡峭，表明对响应值的影响越大，反之则越小。利用 Design Expert 12 软件进行试验优化，且在联系实际的情况下，所得凝胶产品相关因素的适合条件为酶添加量 0.8%，点浆温度 60 ℃，蹲脑时间 25 min。