红米起源于中国，是糙米的一种，因色素沉淀在果皮和种皮上而显现出特定颜色，故得此名。目前，红米主要分布在我国福建、广东、广西、江西、云南等地。安徽省阜南县因地处淮河中游北岸，气候温和湿润、土壤肥沃，适合红米种植。据地方志记载，早在汉代，阜南富陂红米就因“色如胭脂、香糯滋补”被列为贡米之一。红米富含脂肪、蛋白质、膳食纤维，以及钙、铁、硒等多种矿物质元素，且整体营养高于普通大米。每100 g红米中含8~9 g蛋白质，高于精白米（6~7 g），且氨基酸组成较为全面、赖氨酸含量较高，弥补了谷物蛋白的短板。此外，红米蛋白可结合膳食纤维，减少胆固醇吸收，辅助降低低密度脂蛋白含量，同时减缓糖分吸收，适宜糖尿病患者食用。除此之外，红米表层色素含有丰富的花色苷、黄酮等生物活性物质，这些成分可与红米蛋白发挥协同作用，清除自由基，延缓细胞衰老。

目前，对于红米的研究主要集中于花色苷、色素、多酚等活性物质，对红米蛋白提取及其应用研究相对较少。植物蛋白的提取方法主要有水提法、盐析法、酸提法、碱提酸沉法等。碱提酸沉法法结合碱溶、酸沉、直接加热法于一体，利用蛋白质在等电点附近发生沉淀的特点，通过调节溶液的pH值使蛋白沉淀，从而得到粗蛋白提取物。该方法工艺简单、操作方便，在植物蛋白提取中应用广泛。试验以富陂红米为原料，优化碱提酸沉法提取红米蛋白的工艺条件，并进一步研究红米蛋白的溶解性、乳化性与乳化稳定性等功能特性，以期为红米蛋白的综合开发利用提供理论依据。

（一）材料

富陂红米，安徽省瑞平农业科技有限公司提供；大豆油，金龙鱼食品股份有限公司提供。

（二）试剂

浓硫酸、浓盐酸、硫酸铜、硫酸钾、考马斯亮蓝- G250，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供；氢氧化钠、硼酸、95%乙醇、石油醚（30_~60 ℃），均为分析纯，西陇科学股份有限公司提供；牛血清蛋白（≥98%），合肥千盛生物科技有限公司提供。

（三）仪器与设备

HYP304型消化炉、KDN103F型定氮仪，上海纤检仪器有限公司产品；JA1003N型电子天平，上海菁海仪器有限公司产品；JB-2型恒温磁力搅拌器、恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；722型可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司产品；TDZ4-WS型低速自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品；DGT-G135型电热鼓风干燥箱，合肥华德利科学器材有限公司产品；PHS-3C型酸度计，上海仪电科学仪器有限公司产品；BJ-800A型多功能粉碎机，永康市天祺盛世工贸有限公司产品。

（四）试验方法

1. 红米脱脂处理

挑选颗粒较饱满、大小均一的红米，粉碎后过60目筛，用石油醚脱脂（红米粉∶石油醚= 1∶5，g∶mL），磁力搅拌2 h，静置12 h，红米粉与上层有机溶剂分离后，倒出有机溶剂进行回收。重复上述脱脂操作1次，最后将红米粉放在通风橱处24 h，使残留的石油醚充分挥发，得到脱脂红米粉，再于30 ℃烘箱中烘干，装入密封袋保存备用。

2. 红米蛋白等电点的测定

称取1 g脱脂红米粉6份，各加入10 mL蒸馏水，使用浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至10.0，磁力搅拌10 min使其充分反应，搅拌结束后取上清液，分别用浓度为0.1 mol/L HCl溶液调节pH值至3.0，3.5，4.0， 4.5，5.0，5.5，待蛋白质沉淀后，以转速4 000 r/min离心10 min，分别吸取1 mL上清液，于波长595 nm处测定吸光度，吸光度最小的即为红米蛋白等电点。

3. 红米蛋白的提取

取适量脱脂红米粉过60目筛，按照一定料液比加入蒸馏水，用浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值，在特定温度下反应一定时间后，以转速4 000 r/min离心15 min，收集上清液。再用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液调节上清液pH值至红米蛋白等电点，待蛋白质沉淀后，以转速4 000 r/min离心15 min，收集沉淀，水洗至中性，冷冻干燥即得红米蛋白。

4. 单因素试验

称量1 g脱脂红米粉，通过单因素试验研究料液比、碱提温度、碱提pH值和碱提时间对红米蛋白提取率的影响，试验水平分别选取料液比[1∶6，1∶8， 1∶10，1∶12，1∶14（g∶mL）]、碱提温度（30， 35，40，45， 50 ℃）、碱提pH值（9.0，9.5，10.0， 10.5，11.0）、碱提时间（20，40，60，80，100 min），对碱提酸沉法提取红米蛋白工艺进行初步优化，确定各因素的适宜范围，每个处理重复3次，结果取平均值。

5. 正交试验

在单因素试验基础上，对料液比（A）、碱提温度（B）、碱提pH值（C）和碱提时间（D）进行四因素三水平L9（34）正交试验。

正交试验优化碱提红米蛋白工艺参数见表1。

6. 蛋白质含量的测定

红米中蛋白质含量采用《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中的凯氏定氮法测定，最终确定红米中粗蛋白为（14.41±1.22）%。提取液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定，以牛血清蛋白为标准溶液，以标准牛血清蛋白含量为横坐标（X），以溶液吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线为Y=0.006 3X+0.127 7（R2=0.998 6）。

式中：m——根据样品的吸光度从标准曲线计算得到的蛋白质含量，μg；

VT——提取总液体积，mL；

m0——样品质量，g；

VS——测定时取用的样品上清液体积，mL；

n——稀释倍数。

7. 红米蛋白提取率的测定

参照袁梦等人的方法，用上清液中蛋白质质量与原料中蛋白质质量之比来表示。

8. 蛋白质纯度的测定

参照侯玲等人的方法稍作修改，测定提取蛋白质的纯度。

9. 红米蛋白功能性质研究

参照林莉等人方法，稍作修改。研究红米蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性。

1）溶解性的测定。称取5份0.1 g红米蛋白，分别加入10 mL蒸馏水，用浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液和HCl溶液分别调节样品溶液pH值至2.0，4.0， 6.0，8.0，10.0，采用磁力搅拌器搅拌30 min后，再以转速4 000 r/min离心10 min，取其上清液，测定蛋白质含量。

2）持水性和持油性的测定。准确称取1 g红米蛋白粉5份于干燥烧杯中，加入10 mL蒸馏水，分别用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节pH值至2.0， 4.0，6.0，8.0，10.0，不断搅拌呈浆状，倒入离心管以转速4 000 r/min离心10 min，测定上清液体积。

称取1 g红米蛋白在烧杯中，加入10 mL大豆油搅拌1 min，放置室温下静置30 min，记录此时的体积，然后以转速4 000 r/min离心10 min，记录下离心后上清液体积，前后的体积差即为持油性。

3）乳化性和乳化稳定性的测定。配制5%红米蛋白溶液，在室温条件下搅拌使其充分溶解，定容到100 mL容量瓶中，取20 mL的蛋白溶液和5 mL大豆油混合均匀，在涡旋仪中振荡3 min，形成均一的乳化溶液后，以转速4 000 r/min离心10 min。测量离心管中的乳化层体积和液体总体积。

将上述处理好的乳化样品置于80 ℃下水浴30 min，冷却至室温后再次以转速4 000 r/min离心10 min，记录乳化层体积，计算乳化稳定性。

4）起泡性和起泡稳定性的测定。配制质量分数为5%的蛋白溶液，加入100 mL蒸馏水，各取20 mL分别用浓度为1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节样品溶液pH值至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，倒入离心管，在高速涡旋仪中振荡3 min，记录此时的液面高度h1，静置30 min后，再次记录此时的液面高度h2。

（五）试验数据处理

每组试验重复3次，结果取平均值。单因素试验结果图用Origin Pro 2021软件绘制，显著性分析使用IBM SPSS Statistics 27软件。

（一）红米等电点的测定

pH值对蛋白提取液吸光度的影响见图1。

由图1可知，蛋白质上清液的吸光度在pH值3.0~4.5时呈下降趋势，在pH值4.5~5.5呈上升趋势。当pH值为4.5时，吸光度达到最小值，表明该条件下上清液中蛋白质残留量最少，即蛋白质沉淀最多。这主要因为在溶液等电点时，蛋白质溶液中蛋白质的正、负电荷总和为零，蛋白质间的静电排斥作用减弱，从而使蛋白质颗粒之间更易相互碰撞、集聚并形成蛋白质沉淀，由此判断红米蛋白的等电点为4.5，作为酸沉蛋白质的pH值。

（二）单因素试验结果分析

各因素对红米蛋白提取率的影响见图2。

在固定料液比1∶10，碱提温度40 ℃，碱提时间60 min的条件下，考查碱提pH值对红米蛋白提取率的影响。由图2（a）可知，红米蛋白提取率呈先上升后下降的趋势，在碱提pH值为10.0时，红米蛋白提取率达到最高，为（45.07±0.3）%，可能是由于pH值过高会破坏红米蛋白质的空间结构，导致部分蛋白质变性。因此，选取碱提蛋白的最佳pH 值为10.0。

在固定碱提pH值10.0，碱提温度40 ℃，碱提时间60 min的条件下，考查料液比对红米蛋白提取率的影响。由图2（b）可知，料液比为1∶6 _~ 1∶12时，红米蛋白提取率是逐渐升高的；在料液比为1∶12时，红米蛋白提取率达到（45.90±0.58）%。这可能是由于料液比较低时蛋白溶液黏度较大，流动性差，蛋白质溶出速率较小，随着料液比增加，溶液流动性增加，分子扩散速率增强，蛋白质溶出率增加。当料液比为1∶14时，提取率有所下降。因此，选择最佳料液比为1∶12进行后续蛋白质提取优化试验。

在固定碱提pH值10.0，料液比1∶12，碱提时间60 min的条件下，考查碱提温度对红米蛋白提取率的影响。由图2（c）可知，碱提温度从30 ℃上升到40 ℃时，提取率逐渐上升，之后呈下降趋势，可能是因为温度升高，加快了水分子的运动，使得分子间的立体结构伸展，增大了水分子与蛋白质的接触面积，从而加速蛋白质的溶出，但当碱提温度超过40 ℃后，蛋白质分子空间结构会发生改变，蛋白质内部的疏水基团暴露；同时，高温也会导致淀粉糊化，不利于蛋白的分离，从而使红米蛋白提取率降低。因此，选择碱提蛋白最佳温度为40 ℃。

在固定碱提pH值10.0，料液比1∶12，碱提温度40 ℃的条件下，考查碱提时间对红米蛋白提取率的影响。由图2（d）可知，红米蛋白提取率总体趋势呈先升高后降低，当碱提时间达到80 min时，红米蛋白提取率到达最高，为（45.05±0.10）%。随着碱提时间的延长，提取率反而有所下降，一方面可能是随着碱提时间的延长，蛋白质的溶出达到了饱和的状态，所以提取率会有所下降；另一方面随着碱提时间的延长，蛋白质与淀粉结合，导致蛋白质很难析出。因此，选择最佳碱提时间为80 min。

（三）正交试验结果分析

在单因素试验的基础上，以红米蛋白提取率为评价指标，对料液比（A）、碱提温度（B）、碱提pH值（C）和碱提时间（D）进行四因素三水平L9（34）正交试验。

正交试验设计及结果见表2。

极差分析表明，各因素对红米蛋白提取率的影响主次因素为B>C>A>D，即碱提温度>碱提pH值>料液比>碱提时间；最优提取条件组合为A2B2C3D3，即料液比1∶12，碱提温度40 ℃，碱提pH值10.5，碱提时间100 min。

（四）验证试验

根据正交试验得到最优提取条件进行3次平行试验，得到提取率分别为55.67%，55.63%，56.93%，平均值为（56.08±0.60）%，高于正交试验中任意一组。因此，可确定料液比1∶12，碱提温度40 ℃，碱提pH值10.5，碱提时间100 min，酸沉pH值4.5为红米蛋白的最佳提取工艺。

（五）蛋白质纯度的测定

在最优提取工艺下，测得提取的红米蛋白质纯度为（76.80±0.21）%。

（六）红米蛋白功能性质

1. 红米蛋白的溶解性

pH值对红米蛋白溶解性的影响见图3。

蛋白质的溶解性是蛋白质与水、蛋白质与蛋白质、水与水相互作用的综合结果。当pH值为4时，溶解性降至最低值（54.69±0.21）%，可能是该pH值靠近红米蛋白等电点，致使大部分的蛋白质发生聚沉，使其溶解性降低。随着pH值逐渐升高至碱性范围，蛋白溶解性也不断增大，表明碱性条件下的红米蛋白溶解性要高于酸性条件蛋白的溶解性，这可能与红米蛋白中含有较多的碱溶性蛋白有关。

2. 红米蛋白的持水性

pH值对红米蛋白持水性的影响见图4。

蛋白持水性是指蛋白质结合水分子并能够阻止水渗透的一种能力。由图4可知，随着pH值的变化，持水性呈先下降后上升的趋势，当pH值为4时，持水性降至最低值为（0.35±0.12）mL/g；当pH值在4_~10时，持水性逐渐上升，pH值为10时持水性升至（2.25±0.05）mL/g。这可能是因为pH值靠近等电点，蛋白质分子间电荷几乎为零，使得分子间作用力达到最大，蛋白质结合和收缩，呈现出最低的水化和膨胀。随着pH值增大，蛋白质水化和膨胀性能也增大，其持水性能也增强。

3. 红米蛋白的持油性

pH值对红米蛋白持油性的影响见图5。

持油性是指蛋白质能够吸附游离脂肪并相结合的能力。由图5可知，持油性随pH值的上升呈现先降低后上升的趋势。当pH值为4时，持油性最低；随着pH值逐渐升高，蛋白持油性也逐渐升高。一方面，可能是pH值接近红米蛋白等电点，蛋白质容易沉淀，使得持油性最小；另一方面，随着pH值的上升，蛋白质结构被破坏，导致内部的非极性键暴露，从而提高与油脂的结合能力，使蛋白质持油性提高，当pH值为10时，持油性升至（2.9±0.1）mL/g。

4. 红米蛋白的乳化性及乳化稳定性

pH值对红米蛋白乳化性及乳化稳定性的影响见图6。

乳化性是指在一定条件下，蛋白质与油、水作用后形成乳浊液的一种能力。乳化稳定性是指当改变外在条件时，蛋白质仍能够维持油水混合不分层的乳化特性的能力。由图6可知，在pH值为4左右时，乳化性及乳化稳定性都是最低的，分别（31.90±0.36）%，（29.89±0.11）%，这是因为在等电点附近溶解性较低，大部分蛋白质都以沉淀的形式存在，不能使溶液吸附在水与油的界面上；随着pH值的升高，蛋白质表面也吸附了较多的负电荷，增大了排斥作用，导致蛋白水化层体积增大，从而提高蛋白乳化稳定性。

5. 红米蛋白的起泡性与起泡稳定性

pH值对红米蛋白起泡性与起泡稳定性的影响见图7。

蛋白质的起泡性是指在一定的条件下，蛋白质与水分子和空气形成的一种独特形态混合物的能力。起泡稳定性是指一种能够维持已经形成的泡沫稳定的性能。由图7可知，随着pH值的上升，蛋白起泡性和起泡稳定性都呈现先下降后上升的趋势。已有研究显示，蛋白的起泡性及起泡稳定性与溶解性有着密切的关系，在pH值为4时，起泡性处于最低值（22.45±0.15）%，起泡稳定性达到最低值（71.80±0.03）%；在pH值为10时，起泡性升至（24.96±0.22）%，起泡稳定性升至（82.62±0.12）%。这可能是因为该pH值在等电点的附近，蛋白溶解性较差，起泡性和起泡稳定性相对较差。当pH值增大时，其溶解性也会随之增大，使得蛋白质分子间相互作用力增强，从而更容易形成稳定的气泡，且能维持更长时间。