黄酒是世界三大酿造酒之一，不同区域的黄酒各具特色，这与其所使用原料和发酵酒曲密切相关。酒曲根据不同的制备工艺可分为麦曲、小曲和红曲，其中麦曲被称为“酒之骨”，其制备过程中富集的微生物直接影响着黄酒的风味。

乔川黄酒产自庆阳市华池县，具有口感独特、区域性强、可药食两用等多重价值。乔川黄酒麦曲主要以糜谷为原料，混合小麦、中草药等优质原料，经过传统发酵制备而成，是黄酒发酵过程中主要发酵菌的来源，且不同生产环境对麦曲中微生物组成有较大影响。黄酒麦曲含有大量霉菌，霉菌主要在发酵前期通过产生蛋白酶和淀粉水解酶，对蛋白质和淀粉进行分解，为后续酵母酒精发酵提供物质基础。谭婷婷对北方黄酒麦曲霉菌进行了分离，共分离出5株霉菌，研究了霉菌菌株不同生长条件对菌株产酶的影响。贺奕森分离出浓香型白酒大曲中的霉菌，筛选得到高产糖化酶的黑曲霉和高产酸性蛋白酶的米曲霉，并对其最适碳源、氮源等进行了研究。倪海斌等人在藏曲中筛选出高产糖化酶菌株黄曲霉，该黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素，对人体无毒害作用。黄爽爽研究了糜子稠酒发酵中的微生物生态主要是曲霉菌、酵母菌和乳酸菌，并对风味物质的生成进行定性分析。结果表明，霉菌共发酵可显著增加黄酒中氨基酸和有机酸等成分，影响黄酒风味。目前，对庆阳市代表性黄酒乔川黄酒中霉菌研究较少。

从乔川黄酒中分离产蛋白酶霉菌，筛选产酶性能优良的霉菌菌株，并对其产酶特性进行分析，对揭示霉菌对黄酒发酵过程和品质影响有重要意义。

（一）材料

1. 麦曲

选自庆阳市乔川黄酒厂制曲车间，采集时间为2023年12月。

2. 试剂

蛋白胨、琼脂、干酪素、无水乙醇、酵母膏、氯化钠、可溶性淀粉、脱脂乳粉、葡萄糖、溴麝香酚蓝等。

3. 仪器和设备

LS-50 HD型立式压力蒸汽灭菌锅、SPX-150 B型生化培养箱、ZQPL-200型立式全温振荡培养箱、JB- HS-1300 W型超净工作台、XSO-4 C型光学显微镜、DYY-6 C型电泳仪、PCR-96型PCR反应扩增仪等。

4. 培养基

1）PDA培养基、淀粉初筛培养基、淀粉培养 基的配制参考文献。

2）产蛋白酶筛选培养基。脱脂牛乳250 mL，琼脂8 g，蒸馏水250 mL，于108 ℃下高压蒸汽灭菌10~15 min后，与500 mL已灭菌的PDA培养基以1∶1配比混合后使用。

3）葡萄糖氧化发酵培养基。葡萄糖5 g，蛋白胨1 g，氯化钠2.5 g，磷酸氢二钾0.15 g，琼脂0.2%，1%溴香草酚蓝1.5 mL，蒸馏水500 mL。将蛋白胨、琼脂和氯化钠加入纯净水中，加热使其充分溶解，调整溶液pH值至7.2，添加葡萄糖、溴香草酚蓝直至溶解，将溶液均匀分装至试管的1/3位置，于115 ℃下高压蒸汽灭菌15 min。

（二）试验方法

1. 麦曲样品制备

将采集的黄酒麦曲在无菌环境下研磨，混匀后装入无菌袋，于4 ℃条件下冷藏备用。

2. 增殖培养

取上述麦曲10 g，置于含有100 mL经高温灭菌的PDA液体培养基中，用透气膜封口，置于立式恒温振荡培养箱中，在28 ℃下以转速110~120 r/min培养2~3 d。

3. 霉菌的分离

分别取经振荡培养的菌液，用无菌生理盐水稀释到1×10^-6，1×10^-7，取经稀释后的菌液200 μL置于PDA培养基上涂布培养。

4. 霉菌菌种纯化

挑选单个霉菌菌落，用接种环挑取霉菌孢子，在培养皿上弹至数次，于28 ℃下培养2~3 d，直至出现单个菌落。

5. 菌种保藏

将纯化后的菌株在PDA斜面培养基上划线培养，于4 ℃条件下保藏。

6. 显微镜观察

使用接种铲从菌落根部挑取菌丝，将其置于含有生理盐水的载玻片上，盖上盖玻片，制成临时玻片后在显微镜下观察。

7. 生理生化试验

1）唯一碳源试验。在淀粉初筛培养基上接种霉菌，并于28 ℃下恒温培养72 h后观察霉菌的生长状况。若形成霉菌菌落，表明该霉菌能够利用淀粉作为唯一碳源生长，反之则不能。

2）产淀粉酶试验。在淀粉培养基上接种霉菌，置于28 ℃下恒温培养72 h。培养结束后滴取少量碘液于培养基表面，轻轻转动培养皿，使碘液均匀覆盖整个平板。若菌落周围出现透明圈，表明该微生物产生淀粉酶且水解了淀粉；反之，则不具备淀粉酶能力。

3）葡萄糖氧化发酵试验。将霉菌菌株采用穿刺接种法接种到葡萄糖氧化发酵半固体培养基中，置于28 ℃下恒温培养72 h，观察培养基颜色变化。若葡萄糖氧化，培养基则由绿色变为黄色，反之无颜色变化。

4）产蛋白酶试验。在产蛋白酶筛选培养基上接种霉菌，于28 ℃下恒温培养72 h。培养结束后，菌落周围如出现透明圈，表明霉菌有水解蛋白质的能力，反之则不产蛋白酶。通过透明圈与菌落直径比值判断蛋白酶活力。

8. 霉菌的分子生物学鉴定

分离纯化的霉菌由上海生工生物有限公司进行分子生物学鉴定，经抽提DNA、凝胶电泳检测、PCR扩增、测序获得微生物IST序列，在NCBI网站比对，获得鉴定结果，并制作生物进化树。

9. 不同pH值、乙醇体积分数对高产蛋白酶菌株生长的影响

1）将PDA固体培养基的pH值调节为3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，13.0，待试菌株接种后在28 ℃恒温培养箱中培养72 h，培养结束后观察菌落直径。

2）配置乙醇体积分数为0，1%，3%，5%，7%，9%的PDA固体培养基，待试菌株接种后于28 ℃恒温培养箱中培养72 h，培养结束后观察菌落直径。

10. 数据处理

使用Origin，Mega进行数据处理和绘图。

（一）霉菌的形态学观察

共筛选出7株产蛋白酶霉菌，将其分离纯化，在斜面培养基上保藏备用，分别命名为M1，M2，M6，M7，M9，M12和M13。

产蛋白酶霉霉菌菌落与菌体形态见图1，霉菌的菌落特征见表1。

观察菌落形态和菌丝结构，7株菌均呈现菌丝顶端膨大，形成子囊孢子，子囊孢子在菌丝内部聚集，菌丝内部均无隔膜，且无假根和匍匐菌丝，初步鉴定为毛霉属。

（二）霉菌生理生化试验

1. 霉菌的唯一碳源试验

将分离菌株在28 ℃下恒温培养72 h后，观察淀粉初筛培养基上菌落周围是否有菌落或菌丝结构。结果表明，M9菌株无法在仅含淀粉作为碳源的培养基中繁殖，而其他菌株均可生长。其中，M1，M6和M7菌株生长较快，而M2，M12和M13生长缓慢，说明M1，M6和M7能以淀粉为唯一碳源。

2. 霉菌的产淀粉酶能力试验

将分离菌株在28 ℃下恒温培养72 h后，用碘液滴加在菌落周围。培养基中的可溶性淀粉遇碘变蓝，未发现透明圈，表明7株菌株均不具有产淀粉酶的能力。

3. 霉菌的产葡萄糖氧化酶能力试验

葡萄糖氧化酶（GOD）具有极高的特异性，能将β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。GOD作为催化剂促使葡萄糖转化为葡萄糖酸，类似于酸化剂的作用，可调节肠道的pH值，有利于乳酸菌和双歧杆菌等益生菌的繁殖，同时过氧化氢具有抑制肠道内有害菌生长和繁殖的作用。将经穿刺接种后的葡萄糖氧化发酵半固体培养基中，于28 ℃下恒温培养72 h后观察试管颜色变化。

霉菌产葡萄糖氧化酶试验见图2。

由图2可知，7株菌株均能产生葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化发酵斜面培养基均由绿色变为黄色。

4. 产蛋白酶能力试验

将分离得到的菌株接种到产蛋白酶固体培养基上，培养结束后测定菌株菌落与透明圈直径比。

霉菌菌落与透明圈直径比见表2，M2和M7在蛋白酶筛选培养基上的形态见图3。

蛋白酶能将蛋白质分解生成氨基酸类物质，便于发酵微生物利用，同时也增加了黄酒中的营养元素，对人体具有多重功效。由表2可知，经初筛的7株菌株均具有产蛋白酶的能力，通过比较，菌落和透明圈的大小计算D/d值，发现菌株M2和M7产蛋白酶能力较强，其他菌株产酶能力相对较弱。

（三）霉菌的分子生物学鉴定

将M2和M7的ITS序列在NCBI网站进行比对，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。

M2和M7的系统发育树见图4。

由图4可知，菌株M2和M7分别与Lichtheimia ramosa strain（CBS 141828 internal transcribed spacer 1）、Mucor circinelloides strain（IBT-83 18S ribosomal RNA gene）聚集在同一分支，亲缘关系接近，其序列相似性高达99.9%。结合形态学鉴定结果，M2鉴定为总状横梗霉（Lichtheimia ramosa），M7为卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。

（四）产蛋白酶菌株生长特性研究

1. 不同pH值对产蛋白酶菌株生长的影响

将M2和M7分别接种在不同pH值的培养基中恒温培养，从培养16 h开始，每隔8 h记录1次菌落直径，直至72 h结束。通过生长过程中菌落直径变化，判断pH值对菌株生长特性的影响。

M2和M7在不同pH值培养基上的菌落直径见图5。

由图5可知，培养基pH值为3时，M2和M7生长均较缓慢，培养72 h后菌落直径较小，对菌株生长抑制较为明显；M2在pH值为13时培养到72 h同样生长受到抑制，M7在其他pH值范围内生长受到影响较小，说明其对酸碱度的适应性高于M2。黄酒的前发酵过程中有机酸会增加，后期会逐渐稳定。有机酸使黄酒呈现不同的口感和风味，同时有抑制杂菌的作用。M2和M7均有适应酸性环境的能力，在黄酒发酵过程中可作为主要的蛋白质分解菌。

2.不同乙醇体积分数对产蛋白酶菌株生长的影响

将M2和M7分别接种在不同乙醇体积分数的培养基中恒温培养，菌落直径测定方法同2.4.1。

M2和M7在不同乙醇体积分数培养基上的菌落直径见图6。

由图6可知，随着培养基中乙醇体积分数的增加，M2和M7的生长均受到抑制。当培养基中乙醇体积分数为9%时，M2生长抑制率达到73.13%，M7生长抑制率达到69.56%，M7较M2对乙醇的耐受性相对更高；当培养基中乙醇体积分数为1%时，对M2和M7的生长基本无影响；当乙醇体积分数为3%以下，对M2和M7的抑制率较低，说明二者均可适应乙醇体积分数为3%的发酵环境。主要是因为乙醇可能增加微生物细胞膜的流动性而进入细胞，影响微生物细胞内部结构，对霉菌菌丝和孢子的生长产生抑制作用，这一结果与其他学者研究结论一致。