褐藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）是一种主要来源于褐藻的硫酸化多糖，其基本结构为 L-岩藻糖（L-fucose）通过α-1,3 或α-1,4 糖苷键连接，富含硫酸基团及其他单糖（如半乳糖、葡萄糖醛酸等），分子量通常为10~800 ku。研究表明，褐藻聚糖硫酸酯 的生物活性与其硫酸化程度、分子量及糖链分支密切相关。 低分子量褐藻聚糖硫酸酯因溶解性和生物利用度更高，展现出显著的抗凝血、抗肿瘤、抗炎、 免疫调节及抗病毒等活性，已成为功能食品和医药领域的研究热点。然而，天然褐藻聚糖硫酸酯的高分子量和复杂结构限制了其应用，需通过降解技术获取活性更强的低分子量产物。

菌种诱变技术是微生物育种的核心方法，通过物理、化学或生物方法诱导遗传物质突变，进而筛选目标性状突变株。其理论基础在于环境因素或人为干预引发的 DNA 损伤与修复机制失衡，通过碱基错配、染色体断裂、重组或表观遗传修饰等途径打破基因组稳定性，从而扩大遗传多样性。自然诱变源于环境辐射或 DNA 复制错误，自发突变率极低，难以满足科研与育种需求；而人工诱变通过人为干预将突变率提升103_~106倍，已成为遗传改良的核心工具。

目前，主流人工诱变技术主要分为 3 类，化学诱变利用烷化剂 （EMS）或碱基类似物直接损伤 DNA 链，引发点突变或移码突变，适用于大规模随机筛选；辐射诱变通过 X射线、γ射线等诱导 DNA 断裂或碱基修饰，广泛应用于作物抗性育种；生物诱变则借助转座子、CRISPR/Cas9 等生物元件实现靶向编辑，兼具高效性与精准性，但需严格评估其生态风险。随着合成生物学发展，诱变技术正从随机诱导向精准可控演进，其方法选择需综合考虑突变效率、靶向需求及安全性，从而为功能基因组学与合成生物系统构建提供支撑。相比传统的微生物选育方法，菌种诱变技术具有诸多优势：其一，可在较短时间内大幅增加微生物群体的遗传多样性，为筛选具有特定优良性状的菌株提供更丰富的素材；其二，诱变处理相对简单，成本较低，不需要复杂的基因操作技术和昂贵的仪器设备；其三，通过诱变获得的突变菌株遗传稳定性较好，有利于工业化生产中的菌种保存和应用。然而，目前针对超声-紫外复合诱变在褐藻聚糖硫酸酯酶高产菌种中的应用研究仍较为有限。

酶降解法是褐藻聚糖硫酸酯生物降解的主要方法，糖苷酶的特异性可精准断裂糖苷键而不影响硫酸基团含量及其分布，具有产物结构完整、无副反应的优势，现已成为制备低分子量褐藻聚糖硫酸酯的研究热点。近年来，微生物降解因其可持续性和可控性而成为研究焦点，尽管野生菌株（如溶藻弧菌和嗜琼脂类芽孢杆菌等）产酶量较低，但通过诱变技术可显著提升酶活。此外，基因工程手段的应用也为规模化生产高活性酶提供了新途径。未来，应结合结构生物学与酶工程进一步优化，有望推动褐藻聚糖硫酸酯酶在功能食品和生物医药领域的应用。

以国家海藻加工技术研发分中心（大连）前期筛选的嗜琼脂类芽孢杆菌0P16为出发菌株，在已有研究基础上系统开展菌种改良、发酵工艺优化及降解产物功能解析。针对原始菌株产酶效率低、遗传稳定性不足的问题，采用超声-紫外复合诱变技术，通过物理损伤与化学诱变协同机制，获得一株高产褐藻聚糖硫酸酯酶的遗传稳定突变株G16。进一步结合单因素试验与响应面法对突变株的发酵条件进行多参数动态优化，探索超声辅助紫外诱变的协同作用在褐藻聚糖硫酸酯酶高产菌株选育中的应用效果。

（一）试验材料

1. 原料及菌种来源

大连笼目海带褐藻聚糖硫酸酯（FUC）及嗜琼脂类芽孢杆菌（Paenibacillusagaridevo Rans）0P16，国家海藻加工技术研究分中心（大连）提供。

2. 培养基配方

菌株培养基的配制见表1。

3. 试验设备

HH-6型恒温数显水浴锅，上海精科实业有限公司医疗设备厂产品；LDZM-80L-II 型立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；SPX-250BIII 型生化培养箱，天津泰斯特仪器有限公司产品；SW-CJ-2FD 型超净工作台、THZ-82 型恒温振荡器，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；KQ-300B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；全光谱吸收光酶标仪，美国博腾仪器有限公司产品。

（二）试验方法

1. 菌株活化

将冻存菌株0P16于室温下解冻后，采用平板划线法接种至固体培养基，于30℃条件下，倒置培养72 h。无菌条件下选取形态均一单菌落，转接至 20 mL基础液体培养基中，在30℃下，以转速150r/min 振荡培养24 h。

2. 菌种保藏

菌液经离心（在4℃下，以转速4 000 r/min 离心10 min）后弃上清液，加入生理盐水重悬菌体，离心2次。收集菌泥，加入灭菌的 20%甘油作为保护剂，分装至1.5mL 冻存管中，置于-80℃下长期保存。

3. 生长曲线与粗酶液制备

种子液按5%接种量转接至发酵培养基，在 30℃下以转速150r/min 分批培养。分别在 0_~12 h（3h 间隔）、12_~24 h（4h 间隔）、24 h 后（6h 间隔） 取样，同步测定OD600值及酶活。提取粗酶液时，取10 mL发酵液在4℃条件下以转速10 000r/min 离心10 min，上清液与-20℃丙酮（1∶2，V∶V）混合后静置1 h，离心沉淀用浓度为 0.02 mol/L 的Tris-HCl缓冲液（pH 值 8.0）复溶。

4. 生物量与酶活检测

菌株生物量利用比浊法，使用酶标仪在 OD_{600 nm}条件下测定吸光度。

褐藻聚糖硫酸酯酶活检测：将粗酶液与 0.2% Fuc底物（Tris-HCl，pH值8.0）等体积反应（温度30℃，时间120 min），在80 ℃下灭活后加入铁氰化钾显色剂（温度80 ℃，时间 15 min）。离心后取上清液，测定波长 420 nm 处吸光度，参考国晶晶等人的方法测酶活力。

5. 复合诱变与菌株筛选

1）超声处理。取对数期菌悬液（108 CFU/mL），在超声频率40 Hz，超声功率200 W 下处理0_~16 min，筛选 85%_~90%致死率时段。

2）紫外照射。将菌悬液涂布后置于15 W 紫外灯（35 cm）照射0_~26 s，避光培养后确定相同致死率条件。

3）复合诱变。联合优化超声-紫外参数实施复合诱变处理。

6. 突变株筛选

1）初筛。将诱变菌液划线培养72h，挑选生长优势单菌落转接至液体培养基中（温度30 ℃，时间24 h）。

2）复筛。将初筛获得的菌株发酵培养42h 后测定酶活，以原始菌株为对照筛选高产突变株。

7. 遗传稳定性

连续传代培养6次，每代测定发酵液酶活力，评估突变株遗传稳定性。

8. 培养条件优化实验

分别考查接种量（1%，2%，3%，4%，5%，6%）、初始pH值（6.0，6.2，6.4，6.6，6.8，7.0）、培养温度（25，28，30，34，37℃）、碳氮比（4∶1，8∶ 1，12∶1，16∶1，20∶1，24∶1）、NaCl 质量浓度（10，14，16，20，24，28 g/L）、不同氮源（胰蛋白 胨、酵母、蛋白胨、肉汤、硝酸钠、硫酸铵、尿素）对菌株产褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响。利用优化后的培养条件培养，利用铁氰化钾法分别测定发酵液褐藻聚糖硫酸酯酶活。

通过单因素试验初步考查不同培养条件对菌株 G16 降解褐藻聚糖硫酸酯的影响。基于单因素试验的结果，选取培养温度、NaCl 质量浓度、碳氮比、接种量、初始 pH 值 5 个主要效应因子，通过Design Expert 13 设计五因素三水平的响应面试验。基于Boxbehnken设计构建二次多项式模型，确定 G16 降解褐藻聚糖硫酸酯发酵条件及其交互作用对酶活的影响。

（一）超声-紫外诱变条件的确定

对菌株 0P16 超声处理、紫外照射的致死率影响见图 1。

通过诱变结果统计发现，正向突变株多出现在菌体致死率为80%_~90%。由图1（a）可知，0P16 在超声 35 min 时致死率为 86%，超声 45_~50 min 时致死率达 100%。0P16 超声处理时间为35，40，45 min时，菌体致死率分别为86%，89%和95%，表明过度处理会导致菌体完全失活；最佳处理时间均为35 min。由图1（b） 可知，0P16在14 s时达87.15%，24 s时致死率达到100%；最佳处理时间为14 s。紫外（254 nm）诱导嘧啶二聚体形成，结合超声空化效应（20_~40 kHz）增强细胞膜通透性，使枯草芽孢杆菌α-淀粉酶产量提升 1.9 倍。理性设计策略进一步优化了诱变参数，基于响应面法建立的紫外强度（30 mJ/cm）2与超声功率（150 W）交互模型，可使红曲霉 Mona－colin K 合成酶活力增加62%。

（二）褐藻聚糖硫酸酯酶高产菌株的筛选及稳定性测定

根据单因素超声处理和紫外诱变结果，确定最优诱变条件。超声预处理可使细胞膜通透性增加，可能增强紫外线的 DNA 损伤效率，但需平衡处理强度，避免协同致死效应超出目标范围。因此，选择超声处理时间 35 min，紫外照射时间14s 作为复合诱变的处理条件。0P16 复合诱变后，筛选获得一株褐藻聚糖硫酸酯酶活相对较高的突变菌株，编号为 G16。经测定，出发菌株 0P16 产褐藻聚糖硫酸酯酶活为263.56 U/mL，突变株 G16 的产褐藻聚糖硫酸酯酶活为 503.87 U/mL。将突变株 G16 经过 6 次传代培养，对其降解褐藻聚糖硫酸酯酶活进行测定。

菌株 G16 不同传代次数褐藻聚糖硫酸酯酶活见表 2。

由表2 可知， G16诱变 6 代后产褐藻聚糖硫酸酯酶活为 500 U/mL，产褐藻聚糖硫酸酯酶稳定。

（三）单因素发酵条件分析

1. 接种量对菌株 G16 降解褐藻聚糖硫酸酯酶活 的影响

接种量对菌株 G16 降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响见图 2。

由图2 可知，G16 菌株酶活随接种量增加呈先升后降的趋势。接种量从1%逐步上升至5%时达到峰值453.49 U/mL，增幅达112.8%；随后在接种量 6%时显著下降至 395.35 U/mL，降幅为 12.8%。接种量较低时，菌体数量不足，代谢产物积累缓慢，导致酶活偏低；接种量 5%时，菌体密度适宜，有利于酶合成；接种量 6%时，因营养竞争或代谢副产物使酶活下降。

2. 初始 pH 值对菌株 G16 降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响

初始 pH 值对菌株 G16 降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响见图 3。

由图3可知，G16酶活随pH值升高呈抛物线型，初始pH值6.0_~6.6时持续上升增幅为 85.3%，初始pH值6.6 时酶活达峰值448.37 U/mL；初始pH值7.0 时显著下降至395.35 U/mL，表明G16更适应偏中性环境。弱酸性至中性环境利于酶构象稳定，极端 pH 值可能导致菌体代谢抑制或酶变性。

3. 培养温度对菌株G16降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响

培养温度对菌株G16降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响见图4。

由图4可知，培养温度从25 ℃升高至30 ℃时G16酶活增幅为94.7%，最高酶活为565.89 U/mL；随后在培养温度37 ℃时急剧下降64.4%，此时酶活仅为峰值的35.6%。可能与高温导致酶失活或菌体生长停滞相关。

4. 碳氮比对菌株G16降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响

碳氮比对菌株G16降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响见图5。

由图5可知，G16酶活随碳氮比的升高先增后减。碳氮比12∶1时达峰值534.88 U/mL，较碳氮比8∶1上升38.0%。碳源比过高时G16酶活显著下降，当碳氮比大于12∶1导致碳源过剩，抑制氮代谢相关酶表达。

5. NaCl质量浓度对菌株G16产褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响

NaCl质量浓度对菌株G16降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响见图6。

由图6可知，当NaCl质量浓度从10 g/L逐步上升至20g/L时，酶活为465.12U/mL，在NaCl质量浓度24 g/L时显著下降。NaCl质量浓度大于20 g/L时，高渗透压可能破坏菌体膜结构，抑制酶分泌。

6. 不同氮源对菌株G16产褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响

不同氮源对G16降解褐藻聚糖硫酸酯酶活的影响见图7。

通过对比不同培养基成分对酶活性的影响，发现蛋白胨与酵母表现出最优异的促酶活性。由图7可知，蛋白胨与酵母的酶活性显著高于其他成分，而肉汤和尿素的促酶效果最弱，这与刘延波等人的不同氮源对脂肪酶活力的影响结果相似。结果表明，蛋白胨与酵母作为核心培养基成分具有显著优势。

（四）发酵条件响应面优化

1.   回归模型建立及其显著性检验

基于单因素试验的结果，以初始pH值（A）、培养温度（B）、接种量（C）、碳氮比（D）和NaCl质量浓度（E）5个因素为自变量，以酶活为响应值进行响应面回归分析。

响应面设计及结果见表3，回归方程方差分析见表4。

基于Box-behnken设计构建的二次多项式模型，确定了G16发酵条件及其交互作用对酶活的影响。响应面回归模拟方程为：

由表4可知，培养温度（B）、碳氮比（D）及NaCl质量浓度（E）对响应值有显著影响，其中碳氮比（D）影响因素最大。初始pH值与NaCl质量浓度（AE）、培养温度与接种量（BD）、接种量与碳氮比（CD）、接种量与NaCl质量浓度（CE）及碳氮比与NaCl质量浓度（DE）交互效应显著，其中接种量与碳氮比（CD）影响因素最大。所有二次项（A2、B2、C2、D2、E2）均高度显著。模型的p<0.000 1，模型失拟项p=0.405 2> 0.05，试验误差小，表明该模型拟合程度良好。

软件分析得到方程的相关系数R2=0.996 5，调整后R2=0.993 6，再次说明回归方程的拟合程度良好，可用此模型对菌株G16产褐藻聚糖硫酸酯酶发酵条件进行预测。

2. 响应面结果分析

初始pH值和NaCl质量浓度对G16发酵产酶活的响应面和等高线见图8，接种量与培养温度对G16发酵产酶活的响应面和等高线见图9，接种量和碳氮比对G16发酵产酶活的响应面和等高线见图10，接种量和NaCl质量浓度对G16发酵产酶活的响应面和等高线见图11，碳氮比和NaCl质量浓度对G16发酵产酶活的响应面和等高线见图12。

由图8可知，初始pH值与NaCl质量浓度的交互作用（AB）显著，其等高线接近椭圆，表明二者蛋白酶活性，极端初始pH值破坏酶活性位点的电荷分布，导致失活。高盐浓度破坏细胞膜完整性，抑制代谢；而适量NaCl可能稳定酶结构。在中性初始pH值下，适当NaCl可维持细胞渗透压平衡，促进酶分泌；但在极端初始pH值时，盐胁迫加剧酶变性。枯草芽孢杆菌蛋白酶在初始pH值7.0和NaCl质量浓度0.5 g/L时活性最高，偏离此条件时活性下降50%以上。

由图9可知，培养温度与接种量（BC）等高线较接近椭圆形，说明接种量和培养温度之间的交互作用极显著。培养温度对酶活的调控路径与接种量的物理效应互不干扰。高温可能直接抑制菌体生长，接种量决定初始生物量，高接种量缩短延滞期，但可能因溶氧或营养限制导致后期抑制。

由图10可知，接种量与碳氮比（CD）等高线为椭圆，说明接种量和碳氮比之间的交互作用极显著。接种量影响资源竞争，高接种量加速底物消耗。

由图11可知，接种量与NaCl质量浓度（CE）等高线接近椭圆，说明接种量和NaCl质量浓度之间的交互作用极显著。高盐抑制菌体生长，接种量过高时渗透压压力叠加，加剧酶活下降。低接种量下，盐胁迫可能通过群体感应（Quorum sensing）触发应激响应，而高接种量时群体压力超过修复能力。

由图12可知，碳氮比与NaCl质量浓度（DE）等高线接近椭圆，说明碳氮比和NaCl质量浓度之间的交互作用极显著。试验结果为褐藻聚糖硫酸酯酶工业化发酵工艺的精准调控提供了理论依据。

3. 最佳发酵条件工艺的确定

利用模糊数学法确定响应面中各评价对象的酶活，通过Design Expert 13分析得到菌株G16产褐藻聚糖硫酸酯酶的最佳发酵工艺条件进行预测，最佳工艺预测为初始pH值6.53，培养温度29.45 ℃，接种量4.84%，碳氮比11.65∶1，NaCl质量浓度22.41 g/L。在此最佳发酵工艺条件下，菌株G16产褐藻聚糖硫酸酯酶活为534.73 U/mL。根据最佳工艺来进行验证试验的酶活为557.97 U/mL，验证试验的酶活与预测值的相对误差为4.35%，表明模型预测精度较高，工艺优化结果可靠。

4. 诱变菌株生长曲线

诱变菌株G16生长曲线见图13。

由图13可知，G16的生物量在40 h时趋于平稳，生物量高达1.25；G16在42 h时酶活最高，达到612.40 U/mL，但42 h后酶活急剧下降，可能与代谢副产物积累有关。诱变可能通过优化碳氮代谢或增强胁迫耐受性，提高了菌株的产酶效率。