传统发酵蔬菜汁中乳酸菌

的筛选鉴定及肉制品发酵剂特性研究

引用格式

付源，刘传昊，朱双杰，等.传统发酵蔬菜汁中乳酸菌的筛选鉴定及肉制品发酵剂特性研究[J].农产品加工，2025（22）：38-41.

基金项目

安徽省高校重大项目（KJ2021ZD0133）；安徽省高校科研重点项目（2024AH051416）；应用光学国家重点实验室开放基金课题（SKLAO2021001A19）；滁州学院2024年度科研启动基金项目（2024qd41）。

摘   要

从延吉泡菜等传统发酵蔬菜汁中分离筛选出初步断定的乳酸菌36株，又依据发酵肉制品中发酵剂的发酵特性标准进行了二次筛选，仅发现1株编号为W36的菌株满足所有条件。经过对W36菌株形态学观察等鉴定手段，确定W36是戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。充分利用发酵蔬菜菌种资源，丰富了发酵肉制品发酵剂的种类，为中国发酵食品提供理论基础。

关 键 词

传统发酵蔬菜；乳酸菌 ；鉴定；发酵特性

正   文

0   引言

发酵蔬菜是由微生物在蔬菜表面或环境中自然发酵而成的腌制食品。在漫长的历史变革过程中，不同地区发酵蔬菜的生产技术和种类都有了长足的发展^[1]。

发酵蔬菜是发酵食品重要组成部分，富含乳酸菌资源，近年来受到广泛关注。研究表明，不同发酵阶段的优势菌种存在差异。XIONG T等人^[2]在泡菜发酵过程中发现，初期以粪肠球菌为主，中期转为玉米乳杆菌，后期则以植物乳杆菌和干酪乳杆菌为主。LIU A P等人^[3]的研究发现，广源泡菜中乳酸菌占比达74%，其中发酵乳杆菌（62.16%）和德克萨斯乳杆菌（27.63%）为主要菌种，其次是奥里斯乳杆菌和副干酪乳杆菌。WU R N等人[4]在对东北酸菜的研究中发现，发酵初期以乳酸亚种乳酸杆菌为主，中期以乳酸杆菌、乳酸杆菌亚种和植物乳杆菌为主，后期则以棒状亚乳杆菌为主。研究从延吉泡菜等传统发酵蔬菜汁中分离筛选出初步断定为乳酸菌的菌株，又依据肉制品发酵剂关键发酵特性进行复筛，并对其符合菌株进行鉴定，以期为后续的肉制品发酵剂优选试验奠定基础。

1   材料与方法

1.1   试验材料与培养基

试验材料：延吉泡菜、四川泡菜及东北酸菜，均购自吉林省长春市的沃尔玛超市。

培养基：实验室自行配制的MRS液态与固态培养基，以及一系列筛选培养基，均参照相关文献^[5]进行制备。

1.2   仪器与设备

生化培养箱，南京烔创科技有限公司产品；恒温培养摇床，韩国杰奥特有限公司产品；无菌操作台，沈阳精奥仪器科技有限公司产品；电子天平，佛山英鹏特种车辆有限公司产品；蒸汽灭菌锅，广州首诺科学仪器有限公司产品；pH计，杭州米科传感技术有限公司产品。

1.3   试验方法

1.3.1   乳酸菌的分离

首先，从延吉泡菜传统发酵蔬菜汁中各取中心部位的样品10 g，置于拍打机中，加入90 mL无菌质量分数为0.85%的NaCl溶液进行均质化处理。然后，使用质量分数为8.5%的NaCl溶液进行梯度稀释，并吸取适量稀释后的液体，均匀涂布于MRS固体培养基上（含碳酸钙）。随后，在37 ℃下培养48 h。在此期间，随机挑选周围形成碳酸钙透明圈且外观特征符合乳酸菌特征的菌落进行进一步纯化。对纯化后的菌落进行过氧化氢酶测试和革兰氏染色，以辅助鉴定。最后，将初步认定的乳酸菌菌株以20%甘油作为保护剂，再于-20 ℃的条件下进行菌种保存。

1.3.2   乳酸菌筛选路线

菌种筛选路线图见图1。

1.3.3   发酵肉制品发酵剂的筛选

将初步确定乳酸菌菌株进行发酵肉制品发酵剂筛选试验，具体试验方法参照文献^[6-7]。

1.3.4   乳酸菌的鉴定

1）乳酸菌的形态和生理生化特征鉴定。①菌落和菌株形态：分别用肉眼和显微镜观察分离菌落和菌株其形态特征；②生理生化特征：具体试验方法参照文献^[8]。

2）乳酸菌的分子生物学鉴定。细菌样本经上海生物工程技术服务公司进行16S rDNA测序及比对分析，通过相似度和评分鉴定菌株种属，并构建系统发育树。

2   结果与分析

2.1   乳酸菌的分离

从延吉泡菜等传统发酵蔬菜汁中分离筛选出初步断定乳酸菌36株。

乳酸菌的分离见表1。

由表1可知，延吉泡菜12株乳酸菌（记为P1—P12），四川泡菜15株乳酸菌（记为S13—S27），东北酸菜9株乳酸菌（记为W28—W36）。

2.2   发酵肉制品发酵剂的关键发酵特性试验

基于乳酸菌筛选流程及发酵肉制品发酵剂的关键发酵特性测试，对36株候选菌株进行进一步筛选。

菌株P1—P12关键发酵特性试验见表2，菌株S13—S24关键发酵特性试验见表3，菌株S25—W36关键发酵特性试验见表4。

由表2、表3和表4可知，这36株菌株的pH值均落在4~5内，显示出良好的产酸性能。为了后续进行肉制品发酵剂优选试验，依据肉制品发酵剂关键发酵特性进行复筛。进一步分析表4，发现仅有1株编号为W36的菌株符合所有既定标准。W36关键发酵特性是pH值4.6，耐6% NaCl和100 mg/kg NaNO₂，发黏性、葡萄糖产气、产氨、产H₂O₂、产H₂S、V-P反应、硝酸盐还原和氨基酸脱羧酶均为阴性，石蕊牛乳酸凝阳性，能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。W36可作为发酵肉制品的发酵剂进行研究。

2.3   W36乳酸菌的鉴定

2.3.1   W36乳酸菌的形态特征鉴定

W36乳酸菌的菌落形态特征见图2，W36乳酸菌的菌株形态特征见图3。

由图2和图3可知，W36菌株的菌落特征为小尺寸、光滑、隆起、边缘清晰、乳白色、圆形、不透明、具有光泽且质地紧密。在显微镜下观察，该菌株呈现革兰氏阳性（G+）、球形，且倾向于成对或成团生长，这些特征均符合乳酸菌的典型标准。

2.3.2   W36乳酸菌的生理生化特征鉴定

W36乳酸菌的生理生化鉴定见表5。

结合表5中W36乳酸菌的生理生化特性检测结果，参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》^[8]、《伯杰氏系统细菌学手册》^[9]及《常用细菌系统鉴定手册》^[10]的鉴定标准，初步确定该菌株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

2.3.3   W36乳酸菌的分子生物学鉴定

乳酸菌W36 16S rDNA PCR产物扩增图见图4，乳酸菌W36 16S rDNA序列系统进化树见图5。

由图4可知，在1 000~1 500 bp的序列区间内，检测到乳酸菌W36的序列。为了深入了解该乳酸菌，对其进行测序工作，并成功获得了16S rDNA基因序列，长度为1 385 bp。接下来，利用NCBI数据库中的资源，选取了几株与乳酸菌W36可能亲缘关系较近的菌株16S rRNA基因序列作为对比对象。通过应用MEGA 5.0软件，对这些序列进行了转化与比对，并在此基础上构建了系统发育树。由图5可知，W36乳酸菌与Pediococcus pentosaceus CAU：229之间存在着最为紧密的亲缘关系。基于这一发现，可推断乳酸菌W36为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

3   结论

初步筛选了来自延吉泡菜、四川泡菜及东北酸菜的36株菌，并依据发酵肉制品发酵剂的标准进行了2次筛选，最终仅发现1株菌（W36）满足所有条件。W36的主要发酵特性包括在pH值4.6环境下稳定，能承受6%的NaCl和100 mg/kg NaNO₂的，且不具有黏性产生、葡萄糖产气、产氨、产H₂O₂、产H₂S的能力，V-P反应、硝酸盐还原及氨基酸脱羧酶检测均为阴性。同时，W36具有石蕊牛乳酸凝阳性特性，并能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。经过对W36菌株形态学观察等鉴定手段，确定W36是戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

参考文献：

[1]TOLULOPE J A，ANNA R. A holistic review on Euro-Asian lactic acid bacteria fermented cereals and vegetables[J]. Microorganisms，2020（8）：1176-1184.

[2]LIU A P，LIU G R，HUANG C P，et al. The bacterial diversity of ripened Guang'yuan Suancai and in vitro evaluation of potential probiotic lactic acid bacteria isolated fromSuancai[J]. LWT-Food Sci Technol，2017（85）：175-180.

[3]WU R，YU M，LIU X，et al. Changes in flavour and microbial diversity during natural fermentation of Suancai，a traditional food made in Northeast China[J]. International Journal of Food Microbiology，2015（211）：23-31.

[4]FU Y，ZHAO D B，WANG L Y，et al. A broad-spectrum novel bacteriocin produced by Lactobacillus sakei in Nanjing Steamed Roast Duck：Purification，antimicrobial cha-racteristics，and antibacterial mechanisms[J]. Food Bioscience，2022，50（1）：267-281.

[5]李默，朱畅，赵冬兵，等. 发酵肉制品中高抗氧化肉品发酵剂的筛选鉴定[J]. 食品科学，2017，38（12）：83-85.

[6]国家卫生和计划生育委员会. 食品微生物学检验 乳酸菌检验：GB/T 4789.35—2016[S]. 北京：中国标准出版社，2016.

[7]凌代文，东秀珠. 乳酸细菌分类鉴定及试验方法[M]. 北京：中国轻工业出版社，1999：140-152.

[8]布坎南R E，吉本斯N E. 伯杰氏细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京：科学出版社，1984：382-533，660-888.

[9]东秀珠，蔡妙英. 常用细菌系统鉴定手册[M]. 3版. 北京：科学出版社，2001：242-256. ◇